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Cas9x 海星生物—生命科學(xué)發(fā)展的能工巧匠

2021-03-19 17:40 作者:Cas9X海星生物 0人讀過 | 我要投稿

今天我們要講的是生命科學(xué)發(fā)展的能工巧匠—基因編輯技術(shù)，該技術(shù)通過人為的對(duì)目的基因進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)其編輯功能，從而達(dá)到改變目的細(xì)胞基因型的目的。

2020年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了詹妮弗·杜德納(Jennifer Doudna)和艾曼紐·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)，以表彰他們對(duì)基因編輯技術(shù)CRISPR的研究成果。在CRISPER-Cas9技術(shù)開發(fā)之前，第一代鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)以及第二代轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）已被廣泛應(yīng)用。三者的原理都是通過在基因組序列上誘導(dǎo)雙鏈斷裂(DSB)，并隨后通過內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制進(jìn)行糾正，達(dá)到基因片段缺失、插入、突變等基因編輯的目的。

通過同源重組(HR)將內(nèi)源性基因組序列與外源供體DNA分子進(jìn)行交換是一個(gè)幾十年前就已為人所知的過程。已故的奧利弗·史密斯(Oliver Smithies)首次闡明了同源DNA分子如何重組并正確插入哺乳動(dòng)物染色體的特定位置。為此，史密斯與馬里奧·卡佩基(Mario Capecchi)以及馬丁·埃文斯(Martin Evans)共同獲得了2007年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。?

2009科學(xué)家首次使用ZFNs技術(shù)制造了世界上第一個(gè)基因敲除大鼠，1996年ZFNs技術(shù)被大力發(fā)展，該技術(shù)通過改造ZFN的結(jié)構(gòu)域，可以人為設(shè)計(jì)識(shí)別特定DNA的ZFN并促使其與目的DNA序列進(jìn)行結(jié)合，隨后，核酸內(nèi)切酶FOKI可對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割形成DSB，最后完成DNA的自我修復(fù)。該技術(shù)在發(fā)展過程中有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，效率較高的特點(diǎn)，但是隨著科學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)其具有周期長(zhǎng)、易脫靶?、細(xì)胞毒性大的缺點(diǎn)。

第二代基因編輯技術(shù)TALEN作為ZFNs的替代產(chǎn)品，在2021年進(jìn)入快速開發(fā)期，2012年，科學(xué)雜志將TALEN技術(shù)列入了年度十大科學(xué)突破列表，TALE的全稱是Transcription Activator-Like Effector，即轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白，來源于植物病原菌， TALEN技術(shù)的主要原理是通過兩個(gè)TALE靶向識(shí)別靶點(diǎn)兩側(cè)的序列；每個(gè)TALE融合一個(gè)FokI內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域；FokI通過TALE靶向形成二聚體切割靶點(diǎn)，誘導(dǎo)雙鏈斷裂，促使DNA進(jìn)行自我修復(fù)過程并最終達(dá)到基因編輯的目的，TALEN具有技術(shù)設(shè)計(jì)靈活識(shí)別特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

ZFNs用30個(gè)氨基酸組成一個(gè)對(duì)應(yīng)三堿基的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域，而TALE蛋白用34個(gè)氨基酸組成一個(gè)僅精準(zhǔn)對(duì)應(yīng)一個(gè)堿基的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域。此外，相比于ZFNs技術(shù)，TALE有一個(gè)決定性的優(yōu)點(diǎn)，就是可模塊化，通過刪減、添加、自由組合不同的TALE蛋白，就可以輕易地定位DNA片段，將基因編輯周期縮短。但是，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法還是電穿孔法轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞系，病毒所能運(yùn)送的DNA序列也是有限的，而使用病毒侵染法遞送外援DNA進(jìn)行基因治療，轉(zhuǎn)染效率也不可避免地與蛋白質(zhì)大小成反比，所以太大的TALE無疑會(huì)導(dǎo)致DNA的切割效率降低。此外，該項(xiàng)技術(shù)也存在與ZFNs一樣的脫靶率高，細(xì)胞毒性大的缺點(diǎn)。

不過，科學(xué)家們很快開發(fā)出了新一代基因編輯技術(shù)，相比于前兩代技術(shù)更為高校、快捷。準(zhǔn)確且價(jià)位低，那就是我們熟知的CRISPR/Cas9技術(shù)，主要組成部分是成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR以及核算內(nèi)切酶Cas9組成， 2011年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子機(jī)制被揭示, 2014年，一位美國(guó)的生物化學(xué)家Jennifer首先闡明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理，證明它可以根據(jù)一段向?qū)NA（gRNA）的指引，找到對(duì)應(yīng)的DNA序列，并將其切開。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是 crRNA通過堿基配對(duì)與 tracrRNA結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。而通過人工設(shè)計(jì) crRNA 和 tracrRNA 這兩種 RNA，改造成具有引導(dǎo)作用的sgRNA ，從而引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。隨后不久，MIT的華人生物學(xué)家張鋒證明了這一系統(tǒng)同樣可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用。CRISPR/Ca9系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌特有的一種天然防御系統(tǒng)，用于抵抗病毒或外源性質(zhì)粒的侵害。當(dāng)外源基因入侵時(shí)，該防御系統(tǒng)的 CRISPR 序列會(huì)表達(dá)與入侵基因組序列相識(shí)別的 RNA，然后 CRISPR 相關(guān)酶在序列識(shí)別處切割外源基因組DNA，從而達(dá)到防御目的。?

CRISPR/Cas9技術(shù)原理

sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合，形成RNP復(fù)合物
?RNP復(fù)合物在sgRNA的引導(dǎo)下，定位到基因組上的靶位點(diǎn)
Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)的DNA雙鏈進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）
DSB引起細(xì)胞的緊急修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)或者同源重組修復(fù)（HDR）
絕大多數(shù)情況下（>80%），細(xì)胞采用NHEJ修復(fù)路徑，使得靶位點(diǎn)位置隨機(jī)產(chǎn)生個(gè)別堿基的刪除或插入（Indel），得到基因敲除模型
極少數(shù)情況下（<20%），且細(xì)胞內(nèi)存在同源片段時(shí)，細(xì)胞采用HDR修復(fù)路徑，使得靶位點(diǎn)產(chǎn)生精確修復(fù)
在同源片段中引入外源基因片段或者突變堿基，可得到基因定點(diǎn)插入模型或者基因定點(diǎn)突變模型

近幾年，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，涉及在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用， 2017年CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于CAR-T療法；楊璐菡等在Science發(fā)表文章，通過CRISPR/Cas9技術(shù)完成了對(duì)豬基因組中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）序列的敲除。同年，雜交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技術(shù)完成了對(duì)水稻中與鎘吸收和積累相關(guān)的基因的敲除。?

目前為止，關(guān)于CRISPR/Cas9技術(shù)的新突破不斷涌現(xiàn)，相比于前兩代基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)切割效率極高，便利性強(qiáng)，ZFNs與TALENs需要用成百上千個(gè)堿基的長(zhǎng)度來完成定位系統(tǒng)的組裝，而CRISPR則只需要與目的基因一一對(duì)應(yīng)的一段gRNA即可完成這個(gè)任務(wù)，且Cas9蛋白自己本身就具有核酸內(nèi)切酶的活性，不需額外的核酸內(nèi)切酶。為今后大范圍治療點(diǎn)突變遺傳疾病提供了極大的便利。此外，該技術(shù)還有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，能靶向幾乎任意細(xì)胞任意序列的優(yōu)點(diǎn)。

海星生物通過不斷探索，開發(fā)的VIRUS-Free技術(shù)通過構(gòu)建轉(zhuǎn)座系統(tǒng)質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，高拷貝的Cas9蛋白與sgRNA表達(dá)元件被整合到基因組上，比傳統(tǒng)的病毒法節(jié)省了3-4周，價(jià)格節(jié)省了約40%。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，海星生物將緊隨科技發(fā)展的步伐，為您的科學(xué)研究保駕護(hù)航。
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