首先為大家簡(jiǎn)述一下何為EZ Trans Plus 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（Ⅱ）

它作為新一代的轉(zhuǎn)染試劑，其轉(zhuǎn)染原理是帶正電的聚合物與核酸分?子的帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后，與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用?進(jìn)入細(xì)胞。

使用方法（24孔板為例）

1. 接種細(xì)胞

對(duì)于貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前?18-24 h 進(jìn)行鋪板（不含抗生素），使其在轉(zhuǎn)染時(shí)的密度大約在 80%左右。對(duì)于懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在配制?EZ Trans-DNA 復(fù)合物之前進(jìn)行鋪板，每 500 μL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入 4~8×10 5cells。

【注】：培養(yǎng)液中的血清不影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類型及其他實(shí)驗(yàn)條件影響，建議初次使用時(shí)設(shè)置梯度進(jìn)行優(yōu)化最佳使用量。

2. 準(zhǔn)備 EZ Trans-DNA 復(fù)合物

（1）對(duì)于每孔細(xì)胞，將 1 μg 質(zhì)粒 DNA 稀釋到 40 μL 無血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基（或 OPTI-MEM I 培養(yǎng)基），混勻。

（2）對(duì)于每孔細(xì)胞，將 3 μL EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑稀釋到 40 μL 無血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基（或者 OPTI-MEMI 培養(yǎng)基），輕輕混勻。

【注】：無血清的高糖?DMEM 培養(yǎng)基是稀釋液，不能使用含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行 DNA 和 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑的稀釋。因?yàn)?EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過程不能含有血清。

（3）將稀釋好的 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑盡快全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒 DNA 中，輕輕混勻。【注】：此混合的順序不能反向進(jìn)行。

（4）室溫放置 10-15 min，以形成 EZ Trans-DNA 復(fù)合物。

3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

（1）將上述 80 μL EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入到含細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或輕微振蕩，讓?EZ Trans-DNA 復(fù)合物分散均勻。

（2）在 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 6-18 h，去除含 EZ Trans-DNA 復(fù)合物的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)轉(zhuǎn)入基因表達(dá)分析。

【注】：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染細(xì)胞?24 h 后，將細(xì)胞傳代至新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中（將細(xì)胞稀釋 10 倍

以上），在?37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 24 h，加入篩選培養(yǎng)基。在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下，約?1～2 周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域

2. 質(zhì)粒質(zhì)量：請(qǐng)務(wù)必使用高純度無內(nèi)毒素轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒。通過 260 nm 光吸收測(cè)定 DNA 濃度，260nm / 280 nm

比值確定?DNA 純度（比值應(yīng)該在 1.8～2.0 的范圍之內(nèi)）。如有可能，請(qǐng)通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性。

3. 細(xì)胞條件：使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保細(xì)胞沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞

是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞，請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用李記生物的胎牛血清（貨號(hào)：AC03L055）培養(yǎng)細(xì)胞。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)液要求：EZ Trans 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前不需要換培養(yǎng)基。但是，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要求用無血清培養(yǎng)基稀釋?DNA 和轉(zhuǎn)染試劑，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。確保細(xì)胞培養(yǎng)液沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。轉(zhuǎn)染時(shí)培養(yǎng)液中不添加抗生素。

5. 試劑用量的優(yōu)化：DNA 濃度和轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類型及其他實(shí)驗(yàn)條件影響，初次使用應(yīng)優(yōu)化 DNA 濃度和轉(zhuǎn)染試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。使用者可嘗試每?1 μg DNA 使用 1～4 μL 體積 EZ Trans 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例，通常推薦是 1:2~1:5。

附1：

常見問題：

Q1：李記有3款轉(zhuǎn)染試劑，這3款有什么區(qū)別？和Li**對(duì)比效果如何？

A1：我司自行測(cè)試與收集客戶反饋數(shù)據(jù)，得到類似結(jié)論：

　　效率方面：EZ Trans Plus＞Li**2000≈EZ Trans(高效)＞Li** 3000＞EZ Trans(低毒)

　　毒性方面：EZ Trans(低毒)≈Li**3000＜EZ Trans Plus＜EZ Trans(高效)≈Li**2000

Q2：我們傳的細(xì)胞有抗生素，抗生素是絕對(duì)會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎？

A2：能不加盡量不加，理論上抗生素進(jìn)不到細(xì)胞內(nèi)，但是在轉(zhuǎn)染試劑的作用下，細(xì)胞的通透性增加，抗生素可能進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果完成影響。

Q3：protocol提到，要用Opti-MEM稀釋質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑。不能用1640稀釋么？另外質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑為什么要先稀釋然后再混合？不能把轉(zhuǎn)染試劑直接加到質(zhì)粒溶液中混合，然后再加培養(yǎng)基稀釋么？

A3：EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液屬于陽離子類型的轉(zhuǎn)染試劑，它與DNA形成復(fù)合物需要一定的條件，在合適的濃度下，有利于陽離子包裹DNA形成良好形態(tài)的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。

如果直接把兩者直接混合，兩者容易很快形成聚合物，聚集相態(tài)多樣，有可能使DNA暴露在表面，不容易進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而降低轉(zhuǎn)染效率。所以EZ Trans和DNA的混合順序也很重要。?

培養(yǎng)細(xì)胞大多會(huì)用到胎牛血清，血清成分復(fù)雜，沒有人能說清成分及含量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染液成分比較明確，但是不能確定是會(huì)不會(huì)與胎牛血清的不知名成分結(jié)合，事實(shí)上這種現(xiàn)象在大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑中都會(huì)造成不良影響，所以在形成EZ Trans-DNA復(fù)合物過程中要避免血清的影響。

Q4：protocol提到，“24-48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率”指的是去除含復(fù)合物的培養(yǎng)液換成含血清的培養(yǎng)基之后的24-48h，還是指加入復(fù)合物后轉(zhuǎn)染24-48h？

A4：所有時(shí)間都是從EZ Trans-DNA復(fù)合物與細(xì)胞接觸開始算。

Q5：我就是問的體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染小鼠。你們現(xiàn)有的protocol是體外實(shí)驗(yàn)的方法?

A5：體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染目前最多的是腺病毒，慢病毒，腺相關(guān)病毒。轉(zhuǎn)染試劑直接在體內(nèi)用的報(bào)道我們目前沒有聽過?，F(xiàn)有的做法是細(xì)胞在體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染篩選后再打入體內(nèi)。