引|物|設(shè)|計(jì)

20世紀(jì)后期發(fā)展的PCR技術(shù)改變了整個(gè)生物學(xué)研究的進(jìn)程，其中引物設(shè)計(jì)的好壞直接關(guān)系到PCR的成敗。

1引物設(shè)計(jì)的基本原則

引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。在某些情況下（比如構(gòu)建文庫）是在不知道模板序列的情況下進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的，這個(gè)時(shí)候引物核苷酸序列與模板不是完全匹配。我們通常的引物設(shè)計(jì)都是在已知模板序列的情況下進(jìn)行，如下圖1所示：

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引物設(shè)計(jì)總體上包含三個(gè)程序：模板的獲得、同源性分析以及引物篩選。模板的獲得有多種來源，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩矶?，這里不多作討論。同源性分析的目的是看引物與模板有沒有非特異性結(jié)合位點(diǎn)，特別要避免非特異性結(jié)合位點(diǎn)的3’末端完全配對(duì)。為最大程度確保獲得較好的PCR結(jié)果，引物篩選需要滿足以下幾項(xiàng)基本原則：

01引物長度：18-30 nt?

大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長度為18個(gè)核苷酸，引物長度的上限并不是很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。引物越長，退火結(jié)合到靶DNA上形成穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。特殊情況下可以進(jìn)一步延長到50-60 bp，但長引物的合成出錯(cuò)率高，價(jià)格貴，而且難以合成，因此較為少見。另外，上下游引物的長度最好基本相等，最多相差不超過3 bp。

02引物GC含量：40-60%

A、T、G和C四種堿基要在引物中均勻分配，如果引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。

03引物的退火溫度：55～75 ℃

退火溫度需要比解鏈溫度（Tm）低5 ℃，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，反之亦然。一對(duì)引物的退火溫度相差4～6 ℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的。擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物的 Tm值相差不能大于10 ℃。

04避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域

用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。

05引物末端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C

引物在G+C富集區(qū)容易錯(cuò)誤引發(fā)，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3’端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3’端不能終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。

06引物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)

引物自身存在的互補(bǔ)序列會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)從而影響其與模板的結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3 bp。兩引物之間也不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。

07為了后續(xù)操作而產(chǎn)生的不完全匹配

5’端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此可以被修飾而不影響擴(kuò)增特異性，這些修飾包括：添加酶切位點(diǎn)、添加標(biāo)記（生物素、熒光、地高辛和Eu3+等）、引入與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列、引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入啟動(dòng)子序列等。

2特定PCR的引物設(shè)計(jì)

在盡量遵循引物設(shè)計(jì)基本原則的同時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模枰⒁庖恍┫鄳?yīng)的事項(xiàng)，總結(jié)如下：

01熒光定量PCR

熒光定量PCR有染料法和探針法兩種。染料法只需要設(shè)計(jì)引物，而探針法除設(shè)計(jì)引物之外還得設(shè)計(jì)一條探針。

引物設(shè)計(jì)要盡量滿足以下要求：

確保模板是cDNA而不是gDNA；避免重復(fù)堿基（尤其是G）；GC含量為30-80%；Tm值是58-60 ℃；3’端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有超過兩個(gè)的G或C；產(chǎn)物長度一般為80-150 bp最為合適；引物應(yīng)盡可能跨外顯子以免受基因組DNA的影響；查看有無假基因（無功能的DNA序列，與需要擴(kuò)增的目的片段長度相似）存在。

TaqMan探針設(shè)計(jì)應(yīng)注意：

探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物，但不能與引物重疊；長度一般為18～40 bp；GC含量控制在40～80%左右；避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)；在引物的5’端避免使用G；選用比較多的堿基C；退火溫度控制在68～70 ℃左右。

02多重PCR

由于多重PCR體系中同時(shí)存在多對(duì)引物，在引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意：各引物對(duì)必須保持高度的特異性，避免非特異性擴(kuò)增；盡可能避免所有引物間的相互作用；各引物對(duì)應(yīng)保持相對(duì)一致的擴(kuò)增效率，且不同引物對(duì)擴(kuò)增出來的產(chǎn)物能通過電泳或其他方法區(qū)分開。

03Nest-PCR

Nest-PCR，也叫巢式PCR，是一種變異的PCR，使用兩對(duì)而非一對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的目的基因片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增的片段與片段準(zhǔn)相近，第二對(duì)引物稱為巢式引物，與第一段PCR產(chǎn)物結(jié)合來指導(dǎo)第二段PCR產(chǎn)物的合成，這段產(chǎn)物比第一段產(chǎn)物要短。巢式PCR的好處是如果錯(cuò)誤的PCR產(chǎn)物被擴(kuò)增，那么由第二段引物指導(dǎo)的第二次擴(kuò)增的產(chǎn)物錯(cuò)誤的可能性將變得非常低。

04RACE

RACE(Rapid-amplification of cDNA Ends)是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3’端和5’端的方法。一般分5’ RACE和3’ RACE兩種。

3’ RACE較簡單，首先將mRNA或總RNA用Poly T引物反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)一般基因具有polyA尾巴的特點(diǎn)，選用特異引物(根據(jù)已知序列設(shè)計(jì))和Poly T引物PCR即可。

5’ RACE相對(duì)較難，目前流行幾種5’ RACE。其一為加接頭(傳統(tǒng))，根據(jù)接頭引物和自己設(shè)計(jì)特異引物PCR，可以設(shè)計(jì)巢式PCR二次擴(kuò)增。另外，有利用反向PCR技術(shù)，連接成環(huán)再PCR。

特異性引物應(yīng)該滿足：

長度為23～28 nt；50～70％的GC含量；Tm值≥65 ℃；避免使用與AP1互補(bǔ)的引物，尤其是在3’末端；如果要用重疊片段來檢測設(shè)計(jì)的引物，GSp1和GSp2之間至少是100～200 bp。

05測序

一般來說，測序引物的設(shè)計(jì)要比普通PCR嚴(yán)格，應(yīng)遵循以下原則：長度15～25 bp，一般常用20 bp（根據(jù)GC含量作適當(dāng)調(diào)整）；3’端應(yīng)盡量選擇G或C堿基；Tm值為50～70 ℃；GC含量在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續(xù)結(jié)構(gòu)；避開引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體結(jié)構(gòu)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)；保證引物和模板100%匹配，特別是3’端的幾個(gè)堿基一定要完全匹配，同時(shí)必須嚴(yán)格保證引物和模板之間只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

06簡并引物的設(shè)計(jì)

簡并引物是根據(jù)某些特定的目的而選用的一組混合物，指在寡核甘酸的某一位置（一個(gè)簡并位）上有多個(gè)堿基存在于不同的寡核甘酸分子中。

簡并引物常用于從已知蛋白到相關(guān)核酸分子的研究以及用一組引物擴(kuò)增一類分子。在上述兩個(gè)主要應(yīng)用中，需要注意以下兩個(gè)問題：

1從蛋白到核酸，應(yīng)注意：盡量選擇簡并度低的氨基酸區(qū)域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū)；充分注意物種對(duì)于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性；引物不要終止于簡并堿基，對(duì)于大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位；在簡并度高的位置，可用次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。?

2用一對(duì)簡并引物擴(kuò)增一類DNA分子時(shí)，同樣遵循上述總的原則，即盡量降低引物的簡并度，尤其在3’末端或近3’末端。?在此種應(yīng)用中，應(yīng)先利用工具軟件或其他工具找到這些分子的保守區(qū)，然后根據(jù)共有序列，應(yīng)用上面所述的一些原則來設(shè)計(jì)所需要的引物。

3常用的軟件

軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以“Oligo 6”最優(yōu)秀；其次是引物的自動(dòng)搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同，因此自動(dòng)搜索的結(jié)果也不盡相同。自動(dòng)搜索功能以“Premier Primer”最強(qiáng)且方便使用，“Oligo 6”其次，其他軟件如"Vector NTI Suit"、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動(dòng)搜索功能，但搜索結(jié)果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。引物設(shè)計(jì)軟件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進(jìn)行自動(dòng)搜索，“Oligo”進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可快速設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。

然而，許多引物設(shè)計(jì)的基本原則在實(shí)際應(yīng)用中往往難以做到都符合，我們只能秉著“實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)”這一原則，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否可行，再根據(jù)結(jié)果做出調(diào)整。