編者按

冷凍電子顯微學(xué)在近年來取得了飛速的發(fā)展，成為了結(jié)構(gòu)生物學(xué)中最重要的研究領(lǐng)域之一。微晶電子衍射技術(shù)是冷凍電子顯微學(xué)的一大分支，得益于電子與物質(zhì)的相互作用遠(yuǎn)強(qiáng)于光子，可利用亞微米級(jí)別的微小晶體解析結(jié)構(gòu)，相比傳統(tǒng)晶體學(xué)大幅降低了對(duì)晶體尺寸的要求，也被越來越廣泛地應(yīng)用。

水木未來自創(chuàng)立以來，充分發(fā)揮冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)在產(chǎn)業(yè)界、尤其是藥物研發(fā)中的價(jià)值，利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，完成了200+個(gè)高分辨的生物大分子高分辨率結(jié)構(gòu)解析。此外，利用微晶電子衍射技術(shù)，我們還完成了多個(gè)高分辨的小分子化合物結(jié)構(gòu)解析，最高分辨率達(dá)0.6埃。即使是一種仍處于發(fā)展階段的新興結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，微晶電子衍射技術(shù)已經(jīng)得到了越來越多的藥企青睞。

"Electron beams take aim at pharmaceuticals"

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來自抗癲癇藥物卡馬西平處于納米晶體下的微晶電子衍射(Micro-ED)數(shù)據(jù)可用于確定其三維結(jié)構(gòu)。2010年，晶體學(xué)家Tim Gruene從制藥企業(yè)諾華Novartis的一位科學(xué)家處得知，這家制藥巨頭已經(jīng)收集了大約200萬個(gè)小分子，但其中僅有約10%的小分子可以用X射線晶體學(xué)進(jìn)行分析：它們的共同點(diǎn)在于，都可以被組裝成大型的、高質(zhì)量的晶體，是X射線晶體學(xué)研究的完美樣品。X射線穿過這些晶體所衍射的角度和強(qiáng)度可以被計(jì)算解析，進(jìn)而揭示分子的結(jié)構(gòu)。在當(dāng)時(shí)，X射線晶體學(xué)是揭示三維空間中分子結(jié)構(gòu)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，使研究人員能夠準(zhǔn)確地了解分子的原子是以何種方式相互連接的。在Gruene的回憶中，諾華公司的科學(xué)家曾提到，另外三分之一左右的分子也是晶體，但它們是粉末，這意味著這些晶體太小，無法進(jìn)行單晶X射線分析：當(dāng)用X射線照射時(shí)，它們根本無法提供足夠的數(shù)據(jù)。雖然化學(xué)家有其他方法來確定一個(gè)分子是如何連接的，如核磁共振光譜和質(zhì)譜，這些方法通過推斷的方式來提供連接性，但如果數(shù)據(jù)模棱兩可的話，化學(xué)家就會(huì)把結(jié)構(gòu)弄錯(cuò)。對(duì)于候選藥物來說，錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)將引發(fā)極大的災(zāi)難。當(dāng)首次制造一個(gè)小分子時(shí)，若敲定了錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)，并試圖用不同的化學(xué)途徑對(duì)錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)進(jìn)行還原，就會(huì)導(dǎo)致時(shí)間和金錢的大量損失。此外，錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)還可能致使科學(xué)家錯(cuò)誤地解讀分子在其活性部位的結(jié)合方式，從而使改善化合物生物特性的諸多努力付之東流。

Eldico Scientific的ED-1獨(dú)立式電子衍射儀不需要一個(gè)全職的操作員?Credit@Eldico Scientific幾年后，當(dāng)Gruene開始一項(xiàng)研究蛋白質(zhì)的新工作時(shí)，他突然想到，如果能夠有一項(xiàng)對(duì)較小晶體起作用的技術(shù)，并以某種方式將分析出的圖片進(jìn)行三維組合的話，諾華公司的科學(xué)家們將能夠準(zhǔn)確地確定“另外三分之一”的分子結(jié)構(gòu)。Gruene的新實(shí)驗(yàn)室使用了微晶電子衍射技術(shù)(也稱Micro-ED)，這種技術(shù)的工作原理與X射線衍射類似，但數(shù)據(jù)的來源是電子(而不是X射線)。由于電子與分子的相互作用比X射線更強(qiáng)，因此有可能從小到100納米的晶體中獲得數(shù)據(jù)，這突破了X射線分析所需的微米級(jí)晶體限制。Gruene認(rèn)為，他可以利用電子衍射技術(shù)來解開存放于諾華公司數(shù)據(jù)庫中的那些粉末晶體的結(jié)構(gòu)秘密。不過，蛋白質(zhì)在電子衍射實(shí)驗(yàn)中的制備難度是眾所周知的，于是Gruene將研究重點(diǎn)從蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)向了小分子，特別是小分子藥物。不過，Gruene當(dāng)時(shí)沒有意識(shí)到的是，數(shù)十年來，許多其他的研究小組都在嘗試著開發(fā)能夠分析小分子的電子衍射方法。但這項(xiàng)技術(shù)還沒有被有機(jī)和藥物化學(xué)家以及藥企所接納。在加州理工學(xué)院研究電子衍射技術(shù)的有機(jī)化學(xué)家Hosea M. Nelson說，從20世紀(jì)90年代，科學(xué)家們就已經(jīng)開始使用該技術(shù)研究小分子了，但該領(lǐng)域的領(lǐng)軍人物們 "都在力求完美"：他們想要一種能夠提供精確的鍵長(zhǎng)和角度的技術(shù)。但大多數(shù)研究有機(jī)分子的化學(xué)家們并不追求這些過于細(xì)節(jié)的信息。對(duì)這些科學(xué)家來說，電子衍射最有用地方在于，它能提供關(guān)于連接性的信息，或者能闡釋原子是如何連接在一起的。Nelson用汽車工程師來作了個(gè)比喻。早期的電子衍射研究人員 "正試圖制造每小時(shí)行駛300英里的一級(jí)方程式賽車，不過，一大群客戶需要的只是一輛時(shí)速20英里的代步車。這意味著研究人員和客戶們并沒有建立起有效的溝通。"2018年10月，情況有了轉(zhuǎn)機(jī)，Gruene的研究小組定制了一臺(tái)電子顯微鏡，使它的衍射儀可以對(duì)有機(jī)小分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。為了證明這種技術(shù)對(duì)藥物的適用性，研究人員拆開了一粒感冒藥膠囊，用電子衍射法解析了膠囊中對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen)粉末的結(jié)構(gòu)。(Angew. Chem., Int. Ed. 2018, DOI: 10.1002/anie.201811318)在Gruene小組的論文出現(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)上的一天后，一個(gè)包括Nelson在內(nèi)的加州理工學(xué)院和加州大學(xué)洛杉磯分校的合作團(tuán)隊(duì)在預(yù)印本服務(wù)器ChemRxiv上報(bào)告說，他們同樣能夠利用電子衍射法解決幾個(gè)有機(jī)小分子的結(jié)構(gòu)，包括藥物和天然產(chǎn)品。研究人員還分析了四個(gè)化合物的混合物，它們都被置于同一個(gè)極小的樣品收集器上。加州大學(xué)洛杉磯分校的Tamir Gonen，該報(bào)告的主要作者之一說："實(shí)際上，所有四個(gè)分子的結(jié)構(gòu)都可以直接從該混合物中找出，沒有任何其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法能夠直接從混合物中提供原子分辨率的結(jié)構(gòu)"。這項(xiàng)工作的一篇同行評(píng)審論文于次月發(fā)表在ACS中央科學(xué)雜志上。(2018，DOI: 10.1021/acscentsci.8b00760)這兩篇文章使有機(jī)和藥物化學(xué)家們注意到了這項(xiàng)技術(shù)。從那時(shí)起，Micro-ED變得越來越受歡迎。電子衍射技術(shù)正在摩拳擦掌，準(zhǔn)備在藥物化學(xué)和其他需要有機(jī)小分子結(jié)構(gòu)信息的領(lǐng)域中取得重大進(jìn)展。斯德哥爾摩大學(xué)的電子衍射專家鄒曉冬說："我們已經(jīng)向整個(gè)領(lǐng)域展示了這項(xiàng)技術(shù)的重要性和實(shí)用性。現(xiàn)在，從事藥物研發(fā)的化學(xué)家們需要這項(xiàng)技術(shù)。他們會(huì)發(fā)現(xiàn)，電子衍射技術(shù)使得他們可以用非傳統(tǒng)的方式進(jìn)行藥物開發(fā)。換言之，這項(xiàng)技術(shù)能夠用來探索并制造特定的多晶體（小分子可以采取的不同晶體形式）和共晶體。"在CRO組織NanoImaging Services從事電子衍射工作的Jessica Bruhn認(rèn)為，電子衍射不一定是必要的結(jié)構(gòu)闡明工具，卻有它相應(yīng)的價(jià)值："如果你已經(jīng)有了大晶體，你肯定應(yīng)該做單晶X射線衍射。這個(gè)方法的數(shù)據(jù)質(zhì)量很高，設(shè)備也便宜得多。因?yàn)檫@是一個(gè)非常成熟的領(lǐng)域。不過，當(dāng)你的材料有限，或在大晶體的生長(zhǎng)方面遇到問題時(shí)，電子衍射就會(huì)大放異彩。"因?yàn)殡娮友苌浞治龅膶?duì)象往往是微小的晶體，科學(xué)家們可以在擁有極少量的材料時(shí)使用這種技術(shù)。加州理工學(xué)院的Nelson說："在天然產(chǎn)品的研究中，化學(xué)家們費(fèi)盡心思從植物、細(xì)菌、真菌或其他生物體中提取分子，在這個(gè)領(lǐng)域，材料的數(shù)量和晶體的大小是結(jié)構(gòu)解析的重要限制因素。對(duì)化學(xué)家來說，動(dòng)輒從數(shù)百公斤的天然產(chǎn)品中提取僅幾百毫克材料的苦差事是家常便飯，"幾百毫克"是使用X射線晶體學(xué)和核磁共振光譜學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的最低需求。但是Nelson已經(jīng)能夠使用電子衍射方法來解決復(fù)雜分子的結(jié)構(gòu)，僅需幾納克的材料而已。對(duì)于藥物化學(xué)家來說，電子衍射是一個(gè)工具，能夠將他們制造的化合物可視化，這最大程度地避免了他們?cè)诮Y(jié)構(gòu)研究中的主觀推測(cè)。該技術(shù)也有助于加工化學(xué)家，因?yàn)樗梢宰R(shí)別多晶型。同一原料藥(API)的多晶型可以擁有不同的特性，包括熔點(diǎn)、溶解度和化學(xué)穩(wěn)定性。

一位研究人員正在使用日本理學(xué)公司的獨(dú)立電子衍射儀XtaLAB Synergy-ED Credit@Rigaku諾華公司使用電子衍射技術(shù)的科學(xué)家Grahame Woollam說，電子衍射可以讓科學(xué)家們更好地了解那些正在大規(guī)模生產(chǎn)的原料藥中存在哪些多晶體。"在X射線晶體學(xué)中，晶體學(xué)家們會(huì)挑出一些看起來不錯(cuò)的晶體，但實(shí)際上那可能根本代表不了實(shí)際應(yīng)用中的材料。不過，使用電子衍射技術(shù)，只需將想研究的材料放在透射電子顯微鏡的網(wǎng)格上，然后將其置入儀器并收取數(shù)據(jù)。這就是本質(zhì)的區(qū)別。"最近，斯德哥爾摩大學(xué)和中山大學(xué)的研究人員一同合作，使用電子衍射法解決了對(duì)非甾體抗炎藥吲哚美辛的多形態(tài)問題，據(jù)研究人員所述，這是一個(gè) "47年的誤解"。吲哚美辛自1965年以來一直在市場(chǎng)上銷售。1974年，化學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了該藥物的一種此前未被識(shí)別的多晶型，并認(rèn)為這可能是由熔融或溶液結(jié)晶造成的。來自斯德哥爾摩和中山大學(xué)的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，是結(jié)晶的方法導(dǎo)致了兩種不同的多形態(tài)，其中一種是全新的。這一發(fā)現(xiàn)可能對(duì)藥物的配方產(chǎn)生影響。(Angew. Chem., Int. Ed. 2021, DOI: 10.1002/anie.202114985)電子衍射的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)，在于它能夠快速掃描樣品中的數(shù)千顆晶體，找出其中的雜質(zhì)。Woollam認(rèn)為這種識(shí)別對(duì)質(zhì)量控制和欺詐檢測(cè)很有用。"其實(shí)就是拿一個(gè)膠囊，把內(nèi)容物倒在網(wǎng)格上，然后直接上儀器分析就行了。"電子衍射還揭示了輕原子的位置，包括氫和鋰，這恰恰是X射線晶體學(xué)所不能做到的。Woollam說，這些信息對(duì)于那些尋求監(jiān)管部門批準(zhǔn)或?qū)＠Ｗo(hù)的人來說非常重要，因?yàn)樗芨鼫?zhǔn)確地描述藥物的情況。化學(xué)家可以看到與氮原子和氧原子相連的氫原子，以及配制藥物時(shí)經(jīng)常使用到的的鹽類質(zhì)子。該技術(shù)的影響力甚至延伸到了立體化學(xué)。盡管研究人員過去認(rèn)為這是不可能的，但捷克科學(xué)院的晶體學(xué)家Luká? Palatinus和他的同事最近聲稱，他們可以利用電子衍射來指定一個(gè)分子的立體化學(xué)排列。據(jù)Palatinus說，研究立體化學(xué)需要改變數(shù)據(jù)的處理方式，而不是對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行改變。Palatinus的團(tuán)隊(duì)利用電子衍射解決了丙肝治療藥物索非布韋(sofosbuvir)與L-脯氨酸(L-proline)的共晶體結(jié)構(gòu)--包括立體化學(xué)構(gòu)型。(Science 2019, DOI: 10.1126/science.aaw2560)Palatinus表示，實(shí)驗(yàn)的不斷成功正在吸引更多的科學(xué)家們加入電子衍射領(lǐng)域："這種方法正在被大力推廣，因?yàn)樗男Ч秋@而易見的。" 此外，一些儀器制造商也注意到了這項(xiàng)技術(shù)。賽默飛世爾科技公司現(xiàn)在銷售的軟件使電子顯微鏡可以輕易地被改裝為電子衍射儀，而且另外兩家儀器制造商，Eldico Scientific和Rigaku都在銷售獨(dú)立的電子衍射儀。"電子衍射主要依靠透射電子顯微鏡進(jìn)行，這需要很多電子顯微鏡方面的知識(shí)，"Eldico的首席創(chuàng)新官Petra Simoncic說，他成立Eldico公司的目的是研發(fā)獨(dú)立的電子衍射儀，即ED-1。該儀器的優(yōu)點(diǎn)在于，它不需要使用者了解電子顯微鏡的調(diào)試。研究人員只需準(zhǔn)備好他們的樣品并將它們放入儀器中。一旦樣品進(jìn)入儀器，只需在交互界面中的各種晶體上收集數(shù)據(jù)，每個(gè)晶體大約需要一分鐘。負(fù)責(zé)Rigaku理學(xué)公司X射線單晶衍射儀銷售的Mark Benson說，該儀器受到了熱烈的歡迎。"我在Rigaku工作了17年，這是我見過的最具突破性的發(fā)展。"一些研究人員認(rèn)為這些儀器很貴，Benson給的報(bào)價(jià)相當(dāng)模糊，但他也承認(rèn)這些儀器的價(jià)格不菲。據(jù)Eldico公司的首席創(chuàng)新官Simoncic估計(jì)，Eldico的ED-1儀器價(jià)格在150萬至180萬美元之間。加州大學(xué)洛杉磯分校的Gonen說："我認(rèn)為這些公司正在做的事情有一個(gè)根本性的缺陷，他們對(duì)這些機(jī)器的收費(fèi)太高了。以他們的報(bào)價(jià)，我完全可以從其他公司買一臺(tái)電子顯微鏡，用處反而更多一些。"對(duì)此說法，儀器制造商們不敢茍同。Simoncic表示，一臺(tái)具有所有最新功能的透射電子顯微鏡是更加昂貴的，而且運(yùn)行Eldico的獨(dú)立衍射儀不需要專門的人員，這減少了維護(hù)成本。Benson也補(bǔ)充，這些儀器已經(jīng)證明了它們的價(jià)值。盡管Rigaku的儀器只推出了一年多一點(diǎn)，但用戶已經(jīng)在發(fā)表他們用該儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。對(duì)于那些不想花大價(jià)錢投資電子衍射儀的研究小組來說，這兩家公司也提供合同服務(wù)，研究人員可以把他們的樣品送去做電子衍射分析。成本并不是電子衍射的唯一缺點(diǎn)。Rigaku公司的電子衍射產(chǎn)品經(jīng)理Robert Bücker說，電子只能在真空中傳播，這意味著樣品必須能夠承受真空條件。這對(duì)以水合物形式結(jié)晶的分子或含有大的溶劑通道的分子來說可能是個(gè)挑戰(zhàn)。但目前這個(gè)挑戰(zhàn)是有辦法解決的，通常是通過冷凍樣品。而且，電子衍射技術(shù)并非好評(píng)如潮。普林斯頓大學(xué)研究天然產(chǎn)品的Mohammad R. Seyedsayamdost最近用電子衍射法確定了海藻上的細(xì)菌所產(chǎn)生的滅藻分子結(jié)構(gòu)。(Angew. Chem., Int. Ed. 2021, DOI: 10.1002/anie.202114022)?但他指出，即使該方法能夠?qū)O少量的材料起作用，材料的結(jié)晶仍然是必要條件。Seyedsayamdost說道："你無法改善你需要晶體這一事實(shí)。這只是該方法的一個(gè)固有限制，而且這不會(huì)改變。"他的小組所研究的天然產(chǎn)品中只有一小部分可以被結(jié)晶。加州理工學(xué)院的Nelson近年來一直是電子衍射技術(shù)的倡導(dǎo)者，但他也同意該技術(shù)有局限性：分析極小晶體的能力是電子衍射技術(shù)的魅力所在，但它也可能是一個(gè)缺點(diǎn)。這些小晶體可能不能代表整個(gè)樣品。有幾次，Nelson的實(shí)驗(yàn)室的化學(xué)家在鑒定一種材料時(shí)犯了錯(cuò)誤，這并非因?yàn)樗麄兣e(cuò)了結(jié)構(gòu)，而是因?yàn)樗麄儗?shí)際上看到了一種雜質(zhì)，或樣品中一個(gè)非常小的、不相關(guān)的成分的結(jié)構(gòu)。即使存在著這些缺點(diǎn)，化學(xué)家們也認(rèn)同電子衍射技術(shù)在所有的解析技術(shù)中占據(jù)了一席之地。論及這項(xiàng)是否會(huì)成為一種主流技術(shù)或利基(niche)技術(shù)，這仍有待觀察。維也納大學(xué)的Gruene說，他已經(jīng)聯(lián)系了一些大大小小的藥企，并正在幫助他們使用電子衍射來闡明化合物集的結(jié)構(gòu)，探索曾經(jīng)那神秘的"三分之一"。


水木未來丨視界 iss. 31Credit@C&EN?|?Bethany Halford

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