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前言

近日，美國天普大學胡文輝[1]作為通訊作者在《?Molecular Therapy》期刊發(fā)表了題為：Protein expression/secretion boost by a novel unique 21-mer cis-regulatory motif (Exin21) via mRNA stabilization?的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)一個由21個核苷酸組成的短序列Exin21（CAACCGCGGTTCGCGGCCGCT），其編碼一種被稱為Qα（QPRFAAA）的短肽。Exin21具有一種神奇的魔力，當它被添加到目標基因的編碼區(qū)時，可以極大地增加目標蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。

隨著生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，以mRNA和蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的藥物，例如mRNA疫苗和抗體，已經(jīng)大規(guī)模進入臨床應用，并在COVID-19大流行期間大放異彩。然而，相比于傳統(tǒng)藥物，這類新型大分子藥物制造起來既費時又昂貴，且產(chǎn)量往往不高。因此，如何低成本生產(chǎn)足夠數(shù)量的mRNA和蛋白質(zhì)，成為了限制其發(fā)展的一大挑戰(zhàn)。長期以來，科學家們一直想方設(shè)法找到一種可以提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的普適性方法，例如優(yōu)化啟動子序列，引入增強子元件，密碼子優(yōu)化以及添加Kozak序列、核糖體進入位點（IRES）等等。然而，即使采用了這些策略，一些蛋白質(zhì)仍然保持低表達水平甚至完全不表達。因此，開發(fā)新的、簡單的、通用的、能以較低成本顯著提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法，特別是在需要大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的情況下，仍然是當前的一個研究重點。

Exin21/Qα：mRNA和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)助推器

SARS-CoV-2的研究受到許多病毒蛋白低水平表達的阻礙，因此限制了對COVID-19的研究進展。為了優(yōu)化SARS-CoV-2病毒蛋白的表達，胡文輝團隊將Exin21插入到SARS-CoV-2的包膜蛋白E編碼序列和熒光素酶報告基因之間，發(fā)現(xiàn)Exin21的插入顯著促進了E蛋白的表達和分泌。這種獨特的Exin21（CAACCGCGGTTCGCGGCCGCT）編碼一種特定的七肽（QPRFAAA），命名為Qα。進一步的研究表明，添加Exin21/Qα可以提高多種SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白（S、M和N）和輔助蛋白（NSP2、NSP16和ORF3）、宿主蛋白（IL-2、IFN-γ、ACE2和NIBP）的產(chǎn)量。此外，Exin21/Qα還可以提高假病毒和標準慢病毒的包裝效率，提高了mRNA的合成和穩(wěn)定性。在人抗SARS單克隆抗體的重鏈和輕鏈上添加Exin21/Qα可顯著增加抗體的產(chǎn)生。該Exin21/Qα作為一種通用的蛋白質(zhì)生產(chǎn)助推器，在mRNA和蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的生物制品、藥物和疫苗的開發(fā)應用中顯示出巨大的潛力。

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Exin21/Qα提高mRNA疫苗的產(chǎn)量

添加Exin21/Qα的應用之一就是提高疫苗產(chǎn)量。添加Exin21/Qα使cDNA表達載體中的S蛋白表達增加3～24倍。如果能夠?qū)⑦@種增強應用于大規(guī)模疫苗生產(chǎn)，將大大降低成本并加快COVID-19疫苗的供應。研究者假設(shè)添加Exin21/Qα還可以促進SARS-CoV-2蛋白的mRNA依賴性翻譯，從而提高疫苗接種效率。為了測試這一想法，研究者通過體外轉(zhuǎn)錄生成了帶有Exin21插入的加帽mRNA，并檢查了添加Exin21/Qα是否會在mRNA轉(zhuǎn)染HEK293T細胞中后促進病毒蛋白的產(chǎn)生。研究數(shù)據(jù)顯示，Exin21/Qα的添加以時間和劑量依賴性的方式顯著增加了SARS-CoV-2 S蛋白的產(chǎn)生（圖2A）。研究進一步發(fā)現(xiàn)，這種蛋白質(zhì)生產(chǎn)促進基序可以普遍適用于其他SARS-CoV-2蛋白的mRNA，包括N，E，ORF3以及宿主蛋白ACE2（圖2B、2C）。mRNA疫苗常用N1-甲基假尿苷修飾來提高穩(wěn)定性并降低先天免疫原性。為了進一步驗證Exin21/Qα添加對mRNA疫苗的增強作用，研究者使用N1-甲基假尿苷修飾進行了體外轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，與未修飾的mRNA相比，添加Exin21/Qα使修飾的mRNA表現(xiàn)出更強的增強活性（圖2D）。這些數(shù)據(jù)表明，Exin21/Qα的添加可以通過以轉(zhuǎn)錄無關(guān)的方式促進mRNA穩(wěn)定性和/或翻譯效率來增加mRNA疫苗的產(chǎn)量。

為了進一步確定Exin21/Qα添加是否調(diào)節(jié)mRNA依賴性翻譯，研究者測量了放線菌素D抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯產(chǎn)物的動態(tài)變化。通過gdLuc活性測量，發(fā)現(xiàn)在沒有Exin21/Qα添加的情況下，放線菌素D完全阻斷病毒蛋白E（圖2E）和ORF3（圖2F）的產(chǎn)生。相比之下，盡管有轉(zhuǎn)錄抑制（圖2E、2F），添加Exin21/Qα通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)獨立于轉(zhuǎn)錄起作用。為了進一步確定Exin21添加是否影響靶基因的mRNA穩(wěn)定性，本研究對E和S病毒蛋白使用了傳統(tǒng)的mRNA衰變測定。盡管E和S病毒mRNA在時間過程中表現(xiàn)出不同的變化模式，添加Exin21/Qα使兩種病毒E（圖2G）和S（圖2H）mRNA的半衰期增加了約3～6倍。

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Exin21/Qα提高mRNA的穩(wěn)定性

為了更準確地評估Exin21/Qα添加在調(diào)節(jié)細胞中靶向mRNA動態(tài)變化中的作用，本研究通過雜交鏈式反應（HCR）進行了單分子熒光原位雜交（smFISH）、Click-iT新生mRNA捕獲測定和硫醇（SH）連接的烷基化用于代謝測序（SLAM-seq）。HCR 測定鑒定了E-LG mRNA的典型點狀信號（由LG探針檢測，圖3A）。在相同成像條件下平行的比較分析表明，Exin21/Qα的添加以劑量依賴的方式在6h時顯著增加了每個細胞的點狀信號的數(shù)量和強度（圖3A）。Click-iT新生mRNA捕獲測定（圖3Ba）證實，與E-LG組相比，在脈沖1h時Exin97 / Qα添加組（E-QLG）新生E-LG mRNA合成增強了97倍（圖3Bb）；在脈沖3h時，E-QLG組增強增加到15468倍，而對照E-LG組增加了935倍（圖3Bb）。從脈沖1到3 h，E-QLG組的mRNA合成增加了159倍小于E-LG組的增加（935倍），這可能是由于E-QLG組已經(jīng)飽和了高mRNA水平（圖3Bc）。去除EU（追逐期）后，對照E-LG組的mRNA水平迅速降低；然而，Exin21/Qα的添加使半衰期從0.42小時增加到0.73小時（圖3Bb）。SLAM-seq利用新生RNA的s4U標記和IAA烷基化（用于T > C轉(zhuǎn)換）來映射現(xiàn)有單個轉(zhuǎn)錄本的RNA合成動力學。實驗結(jié)果表明Exin21/Qα的添加增加了脈沖期E-LG新生mRNA的合成。在追逐1 h時，兩組的T > C率繼續(xù)增加到約21%（圖3Cc），但在追逐2h時，對照E-LG組降至13%，而E-QLG組保持19%（圖3C和3D），表明Exin21/Qα的添加增加了E-LG mRNA的穩(wěn)定性。

這些數(shù)據(jù)表明，將Exin21 / Qα添加到給定的靶mRNA中可以顯著提高mRNA的合成和穩(wěn)定性，甚至可能提高了翻譯效率，從而促進了靶mRNA（例如S蛋白mRNA疫苗）的蛋白質(zhì)表達和生產(chǎn)。

結(jié)語

總之，本研究報告了一種新穎而獨特的由21個核苷酸組成的短序列Exin21/Qα，當它被添加到目標基因的編碼區(qū)時，可以極大地增加目標蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。Exin21/Qα除了可以促進蛋白質(zhì)生產(chǎn)外，還可以增加mRNA的穩(wěn)定性。本研究初步發(fā)現(xiàn)，由于mRNA合成增加和mRNA衰變減緩，Exin21 / Qα的存在顯著增加了靶mRNA的水平。新生mRNA合成的增強通過Click-iT和SLAM-seq技術(shù)得到驗證。這一革命性的發(fā)現(xiàn)也將為RNA生物學和蛋白質(zhì)領(lǐng)域開辟一條新的研究途徑。

參考文獻

[1] ZHU Y, SARIBAS A S, LIU J, et al. Protein expression/secretion boost by a novel unique 21-mer cis-regulatory motif (Exin21) via mRNA stabilization [J]. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 2023, 31(4): 1136-58.

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