抗癌活性肽對與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞增殖影響
摘要：該研究旨在探討腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)對食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)細(xì)胞增殖的影響及抗癌生物活性肽(ACBP)對增殖的干預(yù)作用和可能的作用機(jī)制。收集5例手術(shù)切除患者的食管癌組織, 分離培養(yǎng)得到ESCC CAFs并進(jìn)行特征指標(biāo)鑒定; 建立CAFs與ESC細(xì)胞共培養(yǎng)體系, CFSE染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖; 收集CAF-1的條件培養(yǎng)基, 加入ACBP進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)KYSE140細(xì)胞, IncuCyte檢測細(xì)胞增殖; qRT-PCR和Western blot檢測Hedgehog信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。該研究成功分離CAFs, Western blot結(jié)果顯示CAFs均表達(dá)波形蛋白(Vimentin)及纖維連接蛋白(Fibronectin), 不表達(dá)E-鈣黏蛋白(E-cadherin); 相比于單獨(dú)培養(yǎng), 與CAF-1共培養(yǎng)的KYSE140細(xì)胞的CFSE水平降低, 細(xì)胞融合率增加(P<0.05), 細(xì)胞中的GLI1和PTCH1的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05); 相比于條件培養(yǎng)基組, ACBP加入可以使KYSE140細(xì)胞的融合率下降(P<0.05); 相較于單獨(dú)培養(yǎng), ACBP加入后KYSE140細(xì)胞的GLI1和PTCH1的mRNA和蛋白水平顯著下降(P<0.05)。該研究表明, CAFs可以通過激活Hedgehog信號通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖, ACBP可在與CAFs共培養(yǎng)條件下通過抑制Hedgehog信號通路抑制食管癌細(xì)胞的生長。
食管癌是常見的消化道惡性腫瘤, 目前占全球惡性腫瘤死亡率第6位[1]。食管癌在組織學(xué)上主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)。食管癌目前的治療措施以外科手術(shù)為主, 結(jié)合化療及放射治療。盡管靶向治療和免疫治療等新的治療方法已取得長足進(jìn)步, 但食管癌患者的5年生存率依舊徘徊在20%左右[2], 亟待尋找新的更有效的治療方法改善治療效果。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME是癌細(xì)胞啟動(dòng)、進(jìn)展和遷移的利基, 是腫瘤發(fā)生、免疫逃逸的關(guān)鍵[3-5]。其中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是TME的關(guān)鍵成分, 支持癌細(xì)胞的增殖和遷移, 同時(shí)也保護(hù)癌細(xì)胞免受抗癌藥物的毒性, 其參與包括食管癌在內(nèi)的癌癥的發(fā)生、血管生成、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等生理過程[6-11]。
1980年在果蠅中發(fā)現(xiàn)的Hedgehog信號通路, 其是維持組織極性和干細(xì)胞數(shù)量的關(guān)鍵。Hedgehog信號通路的異常激活存在于各種類型的癌癥中[12]。我們前期研究表明, 在癌前病變和食管癌中Hedgehog信號通路的表達(dá)被激活[13-14]?？拱┥锘钚噪?anticancer biological active peptide, ACBP)是本實(shí)驗(yàn)室擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的一種多肽, 前期研究顯示, ACBP在體外和體內(nèi)對胃癌和結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用[15-16]。本研究在建立ESCC細(xì)胞與原代培養(yǎng)CAFs共培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上, 研究ACBP在CAFs存在的條件下是否影響食管癌細(xì)胞的增殖以及是否對Hedgehog信號通路產(chǎn)生影響。
1 材料與方法
1.1 細(xì)胞與主要試劑
人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系KYSE140由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。PBS、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司; Maxima Probe qPCR Master Mix購自Thermo Scientific公司; CFSE Fluorescent Cell Labeling Kit(貨號 ab113853)、PTCH1(貨號ab53715)、山羊抗兔IgG(貨號ab175781)購 自Abcam公 司; TRIzol試劑購自Invitrogen公 司; ImPro-IITM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) (貨號 A3800) 購自 Promega公司; 兔多克隆抗體E-cadherin(貨號20874-1-AP)、Vimentin(貨號10366-1-AP)、Fibronectin(貨號15613-1-AP)、GAPDH(貨號10494-1-AP)購自Proteintech公司; GLI1(貨號2534)購自Cell Signaling公司; 微量總蛋白提取試劑盒購自Invent Biotechnologies公司; BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒購自北京索拉比奧科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)的分離與培養(yǎng)
本研究方案經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(編號: 2013026), 收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)患者的食管癌組織(所有患者均簽訂知情同意書)。將組織置于含有1%青霉素/鏈霉素雙抗PBS中沖洗3次并用剪刀將其切碎成直徑1 mm的組織塊, 然后將其放入100 mm培養(yǎng)皿中并干燥以使其附著于培養(yǎng)皿上, 加入6 mL含有20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基, 于37 °C、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞在4或5天后從組織中生長出來。收集CAFs以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中所用CAFs均在第6代以內(nèi)。
常規(guī)培養(yǎng)CAFs, 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%, 棄去培養(yǎng)基, PBS清洗后加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基, 培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液, 1 000 r/min離心5 min, 收集上清液作為CAFs條件培養(yǎng)基, 保存于–80 °C備用。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將食管癌細(xì)胞KYSE140于含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基, 37°C、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按CFSE Fluorescent Cell Labeling Kit廠家說明書將KYSE140用CFSE染色后, 再將其與CAFs通過Transwell共培養(yǎng), 35 μg/mL ACBP處理48 h, 收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。
1.2.3 ACBP對共培養(yǎng)條件下食管癌細(xì)胞KYSE140增殖的影響 將KYSE140細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中, 常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入CAFs條件培養(yǎng)基, 設(shè)ACBP處理組、ACBP聯(lián)合CAFs條件培養(yǎng)基處理組、CAFs條件培養(yǎng)基組、空白對照組, 每組至少設(shè)3個(gè)重復(fù)孔, 培養(yǎng)72 h, 使用IncuCyte? S3活細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測和分析細(xì)胞生長。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 用TRIzol試劑和ImPro-IITM逆轉(zhuǎn)錄酶制備總RNA和cDNA第一鏈。用于檢測PTCH1、GLI1和GAPDH的引物和探針序列見表1。用2–ΔΔCt法分析目的基因表達(dá)水平, 以GAPDH為內(nèi)參。
1.2.5 Western blot 使用動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞和組織的微量總蛋白提取試劑盒獲取細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量?？偟鞍?30 μg)在100 °C下加熱5 min, 進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。在5%牛奶(w/V)的TBS-T中室溫封閉2 h, 分別與5%牛奶TBS-T中的一抗(稀釋比例均為1?500) E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、GLI1和PTCH1在4 °C孵育過夜。以Alexa Fluor 790標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗(稀釋比例為1?10 000)。使用紅外成像系統(tǒng)(奧德賽LI-COR)采集熒光信號。以GAPDH為內(nèi)參, 結(jié)果使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x_±s)。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。t檢驗(yàn)用于兩組之間的比較。采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較, 以確定多組的統(tǒng)計(jì)顯著性。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定ESCC組織培養(yǎng)4~5天后, 顯微鏡下顯示貼壁的ESCC組織塊周圍有細(xì)胞長出。從5個(gè)ESCC標(biāo)本中分離培養(yǎng)了5個(gè)ESCC CAFs(圖1A, 結(jié)果展示2個(gè)CAFs), 傳代后細(xì)胞形態(tài)均呈長梭形成纖維樣細(xì)胞。在分離的CAFs中通過Western blot檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)和纖維連接蛋白(Fibronectin)的表達(dá)。5個(gè)CAFs均顯著表達(dá)Vimentin, 表達(dá)Fibronectin, 不表達(dá)E-cadherin(圖1B), 說明我們成功分離ESCC CAFs, 并且其中未混有上皮細(xì)胞。
2.2 ESCC CAFs對共培養(yǎng)條件下ESCC細(xì)胞增殖的影響
為了探討 ESCC CAFs是否能促進(jìn) ESCC細(xì)胞KYSE140的增殖, 我們用CFSE染色KYSE140細(xì)胞, 單獨(dú)培養(yǎng)或通過Transwell與1號CAF(CAF-1)共培養(yǎng),然后采用流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度。我們發(fā)現(xiàn), 與CAF-1共培養(yǎng)的KYSE140細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度較低, 表明與CAF-1共培養(yǎng)的KYSE140細(xì)胞比單獨(dú)培養(yǎng)的條件下有更多的增殖細(xì)胞(圖2)。
將CAF-1收集的條件培養(yǎng)基與KYSE140細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示, 培養(yǎng)72 h, 在CAF-1條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的KYSE140細(xì)胞的融合率高于對照組(圖3)。這說明與ESCC CAF-1聯(lián)合培養(yǎng)KYSE140具有更高的增殖活性, ESCC CAF-1可以促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖。
2.3 ESCC CAFs對共培養(yǎng)條件下KYSE140細(xì)胞Hedgehog信號通路的影響
為了明確 CAF-1是否通過激活 Hedgehog信號通路促進(jìn) KYSE140細(xì)胞增殖 , 我們使用Transwell將KYSE140細(xì)胞與CAF-1共培養(yǎng), 與單獨(dú)培養(yǎng)KYSE140細(xì)胞相比, 與CAF-1共培養(yǎng)的KYSE140細(xì)胞中可檢測到PTCH1和GLI1的mRNA表達(dá)水平顯著增加(PTCH1: P=0.016 5; GLI1: P=0.012 9)(圖4A)。Western blot檢測顯示, CAF-1作用后PTCH1和GLI1的蛋白相對表達(dá)量較對照組明顯上調(diào)(PTCH1: P=0.000; GLI1: P=0.005), 差異具有顯著性(圖4B和圖4C), 說明共培養(yǎng)條件下ESCC來源CAFs通過激活Hedgehog信號通路促進(jìn)了KYSE140細(xì)胞增殖。
2.4 ACBP對共培養(yǎng)條件下KYSE140細(xì)胞增殖的影響
如圖5所示, 與對照組相比, ACBP作用48 h后KYSE140細(xì)胞中的CFSE水平顯著升高, 說明ACBP對KYSE140細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用; 在與CAF-1共培養(yǎng)體系中, ACBP對KYSE140細(xì)胞的增殖具有一定的抑制增殖作用 。
2.5 ACBP對共培養(yǎng)條件下KYSE140細(xì)胞中Hedgehog信號通路的影響
為了研究ACBP是否影響KYSE140細(xì)胞的Hedge-hog信號通路, 通過qRT-PCR結(jié)果顯示, 與對照組相比, ACBP可以下調(diào)KYSE140細(xì)胞中PTCH1 (P=0.005 1)和GLI1(P=0.026 8)的mRNA水平(圖6A); Western blot檢測結(jié)果顯示, ACBP單獨(dú)作用后, KYSE140細(xì)胞的PTCH1(P=0.000)和GLI1(P=0.001)的蛋白相對表達(dá)量較對照組明顯下降, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6B和圖6C)。在共培養(yǎng)條件下, ACBP作用可以抑制細(xì)胞的PTCH1和GLI1蛋白表達(dá)(P<0.01), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 討論
腫瘤微環(huán)境中含有多種成分, 包括CAFs、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等, 其中CAFs被認(rèn)為參與了包括食管癌發(fā)展在內(nèi)的所有過程。CAFs分泌多種因子, 包括生長因子、趨化因子和細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)腫瘤和TME中的其他成分。如ESCC來源的CAFs分泌的IL-6不僅支持腫瘤細(xì)胞生長, 而且促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化[17], 調(diào)節(jié)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)及其在腫瘤免疫抑制中的作用[18], 同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移[19]。CAFs對IL-6的表達(dá)上調(diào)了STAT3/NF-κB對CXCR7的表達(dá), 在化療耐藥中起著重要作用[20]。CAFs可以通過分泌TGFβ1[21]和PAI-1[22], 高表達(dá)CXCL1[23], 從而提高食管癌的放化療抵抗。另外, CAFs能夠促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[24]。研究顯示, 在ESCC CAFs的裂解液、條件培養(yǎng)基和外泌體中都有SHH(Sonic Hedgehog)的高表達(dá), 而且CAFs可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞株的增殖和遷移[25]。但是CAFs對ESCC細(xì)胞株本身的Hedgehog信號通路的影響鮮有報(bào)道。本文首先研究了CAFs對食管癌細(xì)胞增殖的影響, 研究結(jié)果顯示, 食管癌細(xì)胞KYSE140 在與CAFs共培養(yǎng)條件下或者CAFs條件培養(yǎng)基中的增殖速度均高于單獨(dú)培養(yǎng)KYSE140組, 說明CAFs能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞KYSE140的增殖。
Hedgehog信號通路最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn), 是一種進(jìn)化上保守的信號機(jī)制, 在胚胎發(fā)生、生長和模式形成中起著重要作用。該通路的重要組成部分包括Hedgehog配體[包括SHH、IHH(indian Hedgehog)和DHH(desert Hedgehog)]、Patched受體(PTCH1和PTCH2)、融合抑制因子(suppressor of fused, SuFu)和GLI轉(zhuǎn)錄因子(包 括GLI1、GLI2和GLI3)。在大多數(shù)研究中, SHH與PTCH1的結(jié)合導(dǎo)致SMO的去表達(dá), 從而激活SHH信號, 導(dǎo)致GLI1向細(xì)胞核的移位[26-27]。核GLI1可以調(diào)節(jié)包括PTCH1和Gli1在 內(nèi)的許多基因的表達(dá)。我們對共培養(yǎng)條件下CAFs對KYSE140細(xì)胞的Hedgehog信號通路標(biāo)志進(jìn)行檢測, 結(jié)果顯示, CAFs上調(diào)KYSE140細(xì)胞中PTCH1和GLI1的mRNA和蛋白水平, 說明CAFs能夠激活食管癌細(xì)胞KYSE140的Hedgehog信號通路, 并且CAFs可能參與對KYSE140細(xì)胞的促增殖作用。
ACBP是本實(shí)驗(yàn)室從山羊臟器中分離得到的一種多肽[28]。前期研究表明, ACBP通過激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 從而在體內(nèi)外抑制胃癌細(xì)胞和胃癌干細(xì)胞的增殖[15-16]; 在結(jié)直腸癌模型中, ACBP通過調(diào)節(jié)PARP-p53-Mcl-1信號通路, 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。此外, ACBP與順鉑聯(lián)合應(yīng)用, 能夠發(fā)揮減毒增敏的作用, 提高荷瘤小鼠的生活質(zhì)量[15]。在我們的研究中, ACBP單獨(dú)培養(yǎng)食管癌細(xì)胞KYSE140可以抑制其增殖, 由于CAFs通過激活Hedgehog信號通路促進(jìn)KYSE140增殖, 我們研究了ACBP是否也干預(yù)Hedgehog信號通路, 發(fā)現(xiàn)ACBP單獨(dú)作用KYSE140可以降低細(xì)胞的 PTCH1和GLI1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。在與CAFs共培養(yǎng)條件下, ACBP同樣可以抑制PTCH1和GLI1的蛋白水平, 具有抑制Hedgehog信號通路的作用, 說明ACBP可以通過調(diào)節(jié)Hedgehog信號通路干預(yù)CAFs對食管癌細(xì)胞的增殖的促進(jìn)作用。
綜上所述, 本研究發(fā)現(xiàn)從食管癌組織中分離的CAFs可以通過Hedgehog信號通路的激活促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖, ACBP可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖, 并通過抑制Hedgehog信號通路來干預(yù)CAFs對共培條件下食管癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。這些結(jié)果為我們理解ACBP的抗癌活性的分子機(jī)制提供了新的見解, 也將為ACBP作為生物活性劑參與治療食管癌提供參考依據(jù)。
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