Q：如何判斷Ct值是否有效？

分為五部分：

一：選取對(duì)照

二：選取合適內(nèi)參

三：判讀圖譜

四、擴(kuò)增效率

一：選取對(duì)照

NTC：即空白對(duì)照。用水代替模板（陰性對(duì)照）

作用：排除體系自身污染

NRT：RNA對(duì)照 --No RT Control ,即 以不加逆轉(zhuǎn)錄酶 做逆轉(zhuǎn)錄PCR的產(chǎn)物為模板

作用：排除基因組自身污染

***若△ct值（NCT-target）≥5 ，則普遍認(rèn)為數(shù)據(jù)可信

二：選取合適內(nèi)參

三：判讀圖譜 ---6小點(diǎn)

1.矯正染料ROX

ROX為惰性染料，不會(huì)跟隨PCR反應(yīng)過程發(fā)生變化

作用：校正加樣誤差

2.擴(kuò)增曲線

分為4個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期、線型增長期、平臺(tái)期。

小Q：為什么同樣的復(fù)孔，會(huì)有不同的平臺(tái)期，即平臺(tái)期分散？

A：平臺(tái)期的高低并不是QPCR的主要關(guān)注點(diǎn)，判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的指標(biāo)應(yīng)為擴(kuò)增效率是否在可接受的范圍內(nèi)。我們應(yīng)該只關(guān)注指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域，如下圖（48個(gè)樣的重復(fù)率肉眼可見的是高的），因?yàn)樗欠虾诵姆匠痰模?..）

因素：1.初始模板投入量的偏差 2.產(chǎn)物的積累，樣品的消耗等產(chǎn)生的影響

3：基線

小Q：為什么會(huì)有基線期？

A：在PCR初始階段，模板量少。其待測(cè)基因積累數(shù)量達(dá)不到響應(yīng)程度時(shí)，機(jī)器無法去讀取穩(wěn)定的熒光信號(hào)的變化。而且受各種因素影響（如機(jī)器本身檢測(cè)情況、反應(yīng)體系等。。。），機(jī)器需要這么一個(gè)基線期對(duì)背景時(shí)期進(jìn)行歸一化處理。

在正常情況下，基線時(shí)期與X軸相平

***若遇到下面情況，即基線期不符合實(shí)際的檢測(cè)過程

這個(gè)不慌，可調(diào)試。

在分析設(shè)置菜單中，找到基線循環(huán)期的初始循環(huán)數(shù)和末尾循環(huán)數(shù)

如圖：

我們可以將末尾循環(huán)數(shù)降低----可以調(diào)回來正常圖譜

（如果基線期是先平行后翹起來的情況，則可以將末尾循環(huán)數(shù)往高了改（將起峰的那個(gè)位置設(shè)置為末尾循環(huán)數(shù)））

4、閾值線

閾值線在靠近X軸，剛起峰的位置

儀器默認(rèn)閾值：在基線時(shí)期熒光定量信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍處

如下圖紅線，只要閾值線在“坡度“”曲線里的“偏直線”處的中間范圍內(nèi)，是可信的。

5、Ct值

Ct值：閾值線與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)。指擴(kuò)增熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（待測(cè)基因表達(dá)量越高，其達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越?。?/p>

***復(fù)孔間的Ct值STD<0.2

6、熔解曲線

Tm值：指雙鏈DNA分子解鏈一半時(shí)的溫度

根據(jù)峰值是否單一來判斷圖譜是否可信

四、擴(kuò)增效率

計(jì)算斜率。

擴(kuò)增效率應(yīng)符合近似值（MIQE）：90%-110%

Q:如何處理相對(duì)定量數(shù)據(jù)？

在跑完定量PCR后。數(shù)據(jù)檢測(cè)看：

基線是否正常；ROX校正是否正常；Ct值；復(fù)孔重復(fù)性

后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算