納米顆粒制劑疫苗:機(jī)遇與挑戰(zhàn)

摘要：疫苗利用免疫系統(tǒng)的固有特性來(lái)預(yù)防疾病或治療現(xiàn)有疾病。人們一直致力于從機(jī)制上理解免疫系統(tǒng)是如何運(yùn)作的，并致力于設(shè)計(jì)高效有效的疫苗。近年來(lái)納米技術(shù)的進(jìn)步為應(yīng)對(duì)免疫學(xué)和疫苗開(kāi)發(fā)方面的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。首先，納米顆粒體系為研究免疫系統(tǒng)的運(yùn)行提供了理想的模型系統(tǒng)，使系統(tǒng)地識(shí)別關(guān)鍵因素并了解其在特異性免疫反應(yīng)中的作用成為可能。此外，納米顆粒系統(tǒng)的多用途組成/結(jié)構(gòu)使開(kāi)發(fā)高效疫苗的新策略/新平臺(tái)成為可能。在這篇綜述中，我們通過(guò)疫苗免疫機(jī)制的框架，討論了納米顆粒的優(yōu)勢(shì)和在疫苗開(kāi)發(fā)中面臨的挑戰(zhàn)。

前言

幾十年來(lái)，免疫學(xué)、分子遺傳學(xué)和納米技術(shù)的進(jìn)展使疫苗研究發(fā)生了革命性變化。從交叉中和流感疫苗1的實(shí)驗(yàn)演示到癌癥疫苗治療的臨床轉(zhuǎn)化，納米顆粒(NP)疫苗一直處于這些創(chuàng)新的前沿。（開(kāi)題報(bào)告講解）納米疫苗是那些具有顆粒狀形態(tài)和大小范圍從幾納米到幾百納米的疫苗。它們?cè)谝呙缃臃N方面具有巨大的潛力，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^(guò)尺寸、形狀、表面修飾等參數(shù)方便地定制成類似于免疫系統(tǒng)中的自然靶點(diǎn)，以優(yōu)化生物分布和與免疫細(xì)胞的相互作用。納米疫苗的材料方面已經(jīng)在最近的文章中進(jìn)行了全面的綜述。5-7然而，隨著發(fā)表的關(guān)于納米顆粒疫苗的研究成果的積累，很明顯，共同的機(jī)制支撐著納米顆粒配方所顯示的優(yōu)勢(shì)。這些機(jī)制是保存在整個(gè)物質(zhì)系統(tǒng)中，并與免疫系統(tǒng)的基本工作緊密相連。理解交互的這些特定特性納米顆粒和免疫系統(tǒng)之間的差異可能會(huì)為改進(jìn)疫苗設(shè)計(jì)帶來(lái)獨(dú)特的機(jī)會(huì)。

本綜述的目的是鞏固與疫苗接種有關(guān)的免疫機(jī)制的現(xiàn)有信息，這些信息往往分散在免疫學(xué)的廣大和已建立的領(lǐng)域。

我們將從免疫和疫苗接種的生物學(xué)方面的基本討論開(kāi)始，強(qiáng)調(diào)基于納米顆粒的研究對(duì)免疫學(xué)研究領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，以便了解納米顆粒和免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系。我們關(guān)注涉及樹(shù)突狀細(xì)胞的主要途徑(其他途徑，如巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的等，不在本綜述的范圍內(nèi))，并進(jìn)一步闡述顯著的NP疫苗演示是如何通過(guò)利用已知的有益相互作用實(shí)現(xiàn)卓越療效的。最后，我們強(qiáng)調(diào)了當(dāng)前納米顆粒制劑疫苗所面臨的挑戰(zhàn)，并提出了未來(lái)納米顆粒制劑疫苗發(fā)展的方向。

簡(jiǎn)單介紹免疫反應(yīng)（基礎(chǔ)知識(shí)）

免疫系統(tǒng)由一組細(xì)胞和可溶性成分組成(表1)。它負(fù)責(zé)維持體內(nèi)平衡8并對(duì)任何物質(zhì)進(jìn)行防御檢測(cè)到異常。這些異?？赡苁潜徊≡w感染，9,10癌細(xì)胞的出現(xiàn)，11或誤解正常信號(hào)導(dǎo)致自身免疫檢測(cè)到異常。同時(shí)，病原體及其引起的相關(guān)損傷被樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)檢測(cè)到，樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)病原體進(jìn)行取樣并遷移到淋巴結(jié)。在那里，樹(shù)突狀細(xì)胞向T細(xì)胞提供抗原，導(dǎo)致T細(xì)胞的激活，T細(xì)胞作為免疫反應(yīng)的中心協(xié)調(diào)者，對(duì)病原體或細(xì)胞毒細(xì)胞消除病原體感染的自身細(xì)胞。擴(kuò)散或由樹(shù)突狀細(xì)胞攜帶到淋巴結(jié)的同源病原體抗原被B細(xì)胞識(shí)別，刺激抗體的產(chǎn)生。這些抗體通過(guò)結(jié)合中和病原體毒性并增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力。先天免疫功能和適應(yīng)性免疫功能共同作用于病原體的清除和感染的解決。

?

從基于納米顆粒的模型系統(tǒng)學(xué)習(xí):對(duì)免疫系統(tǒng)的高級(jí)理解

傳統(tǒng)的免疫學(xué)知識(shí)是建立在基于小分子工具的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之上的。較好的例子包括用分離的細(xì)胞因子或病原體成分進(jìn)行免疫細(xì)胞活化的研究。利用基于納米顆粒的模型系統(tǒng)對(duì)免疫系統(tǒng)的研究在不止一個(gè)方面促進(jìn)了我們的理解。與小分子不同，納米粒子的體積和表面積使其具備多種功能，其作用不再局限于生物化學(xué)領(lǐng)域。同樣的特征也使它們能夠模擬自然病原體的形態(tài)和一些物理/化學(xué)性質(zhì);然后，這些參數(shù)可以受控地進(jìn)行調(diào)整，以便各自對(duì)免疫系統(tǒng)功能的影響可以獨(dú)立研究。

為了了解各種免疫反應(yīng)的途徑，納米顆粒通常被用作病原體關(guān)鍵成分的載體系統(tǒng)。人們很快意識(shí)到，納米顆粒載體和免疫細(xì)胞之間的物理和化學(xué)相互作用決定了免疫反應(yīng)的結(jié)果。抗原的重復(fù)排列是病原體表面的自然特征，它比隨機(jī)聚集的抗原更能刺激B細(xì)胞的反應(yīng)。Kanekiyo等人使用自組裝的蛋白質(zhì)納米顆粒以八面體對(duì)稱排列流感HA抗原，證明了定義的對(duì)稱也是刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的一個(gè)重要因素1(圖1a)，這引起了人們的興趣病毒的幾何特征如何在免疫細(xì)胞刺激中發(fā)揮作用的問(wèn)題。（開(kāi)題報(bào)告講解）

?

在具有確定對(duì)稱性和密度的納米顆粒上裝載病原體相關(guān)特征表明，對(duì)免疫細(xì)胞的最佳刺激有一個(gè)幾何要求。另一個(gè)例子表明，單分子CpG分子佐劑需要在納米顆粒表面呈現(xiàn)以達(dá)到最佳效果。Gungor等人證明將CpG配體組裝成納米環(huán)進(jìn)一步增強(qiáng)了佐劑效果26(圖1b)。這些結(jié)果表明，當(dāng)免疫細(xì)胞在初始階段與病原體通信時(shí)，配體和受體微域之間可能存在空間/幾何關(guān)系。

?

使用預(yù)定義大小的納米顆粒進(jìn)行淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，豐富了我們對(duì)不同生物實(shí)體如何進(jìn)入適應(yīng)性免疫室并與之相互作用的理解。27-30 Reddy等人。首次演示了粒徑優(yōu)先的淋巴管轉(zhuǎn)運(yùn)，使用聚丙烯硫化物(PPS)為基礎(chǔ)的納米顆粒，粒徑分別為25、40和100納米。通過(guò)將這一發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于疫苗應(yīng)用，他們進(jìn)一步證明，在小鼠模型中，25 nm而不是100 nm的PPS納米顆粒有效地引流到淋巴結(jié)將轉(zhuǎn)化為更強(qiáng)的B細(xì)胞反應(yīng)。（開(kāi)題報(bào)告講解）

基于工程納米粒子的人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPCs)最近成為一種重要的模型系統(tǒng)，用于理解樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞之間的通信?；陬w粒的aAPCs的構(gòu)建通常包括在納米顆粒表面裝飾DC膜蛋白，如表位結(jié)合的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子和共刺激配體，這些蛋白參與DC和T細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞。人們發(fā)展了各種生物偶聯(lián)技術(shù)，將蛋白質(zhì)與納米顆粒表面進(jìn)行化學(xué)連接。與自由溶解的配體相比，這些信號(hào)分子在納米顆粒表面的呈現(xiàn)允許在更接近于天然配體的條件下與T細(xì)胞相互作用，因?yàn)?strong>T細(xì)胞上的信號(hào)受體聚集在亞微米大小的區(qū)域44 - 46。這些細(xì)胞系允許對(duì)外周血細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)進(jìn)行定制的和可復(fù)制的激活，但由于生物安全方面的考慮，如可能對(duì)外來(lái)細(xì)胞系產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞系僅限于體外應(yīng)用。基于合成粒子的aapc避免了這些生物危害，同時(shí)保持靈活性，為T(mén)細(xì)胞相互作用提供一組預(yù)定義的信號(hào)分子。因此，它們已被用于研究T細(xì)胞在體外和體內(nèi)的活化?；陬w粒的aAPCs已被應(yīng)用于T細(xì)胞相互作用的生物物理要求的體外研究利用PLGA微粒，Sunshine和同事研究了MHC和共刺激分子在球形和橢球粒子上的呈現(xiàn)。他們觀察到T細(xì)胞和兩種粒子之間的相互作用截面是不同的，這導(dǎo)致了T細(xì)胞的不同激活。依賴于T細(xì)胞和APCs之間相互作用截面的面積或幾何形狀，以獲得最佳的T細(xì)胞激活。在另一個(gè)新的應(yīng)用中，Santamaria和同事設(shè)計(jì)了表面裝飾由MHC分子與自身抗原肽復(fù)合組成的氧化鐵納米顆粒，以模仿免疫抑制樹(shù)突狀細(xì)胞。顆粒表面mhc -肽復(fù)合物的密度是控制Treg.51刺激的關(guān)鍵。

疫苗及其類別的定義

疫苗利用免疫系統(tǒng)的固有特性產(chǎn)生保護(hù)和治療作用。疫苗配方的基本成分是抗原和佐劑。它們分別為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)提供致病因子的身份，以便進(jìn)行特定的反應(yīng)，并提供關(guān)于疾病性質(zhì)的信息，以便指導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。抗原主要是用于T細(xì)胞反應(yīng)的蛋白質(zhì)(但它們可以采取不同的形式，如多糖、核酸或一些合成材料，用于B細(xì)胞反應(yīng))。佐劑可以是免疫原性小分子，分子遺傳工具，如mrna或sirna，或特殊設(shè)計(jì)的合成材料，如納米顆粒。疫苗的目的是提供樹(shù)突細(xì)胞,充當(dāng)適應(yīng)性反應(yīng)的引發(fā)劑,用適當(dāng)?shù)奶禺惪乖妥魟┌l(fā)起正確極化所需輔助T細(xì)胞反應(yīng),并產(chǎn)生所需的套互補(bǔ)的效應(yīng)細(xì)胞,如細(xì)胞毒性T細(xì)胞和B細(xì)胞。

圖2說(shuō)明了對(duì)不同疾病的保護(hù)相關(guān)物的要求一些病毒和細(xì)菌只需要疫苗來(lái)誘發(fā)保護(hù)性水平的抗體(產(chǎn)生)B細(xì)胞)對(duì)表面蛋白質(zhì)或分泌的毒素提供保護(hù)。例如人類乳頭瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、白喉和肺炎球菌。另一些則需要誘導(dǎo)CD4+或細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)反應(yīng)來(lái)預(yù)防感染。CD4+ T輔助細(xì)胞協(xié)調(diào)先天和適應(yīng)性系統(tǒng)對(duì)抗疾病因子的作用，CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞消除感染/突變細(xì)胞。對(duì)于癌癥，CD4+和細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)相結(jié)合是有效的需要。

?

圖2不同疾病對(duì)防護(hù)相關(guān)物的要求。人乳頭狀瘤病毒:人乳頭瘤病毒;HAV:甲型肝炎病毒;乙型肝炎:乙型肝炎病毒;西尼羅河病毒;MRSA:多重耐藥金黃色葡萄球菌。

疫苗分為兩類:預(yù)防疫苗和治療疫苗。預(yù)防性接種，又稱保護(hù)性接種，是指針對(duì)常見(jiàn)病原體的疫苗。它是基于對(duì)疾病病原體誘導(dǎo)的免疫記憶(由特定抗原介導(dǎo))和記憶細(xì)胞在隨后接觸相關(guān)病原體時(shí)迅速反應(yīng)的能力。不出所料，整個(gè)減毒活病原體包含了所有抗原和自然佐劑，這些抗原和佐劑都是誘導(dǎo)強(qiáng)效應(yīng)答所必需的，所以它們已經(jīng)成為疫苗開(kāi)發(fā)的一個(gè)有效平臺(tái)。最顯著的例子是全減毒黃熱病疫苗YF-17D，已知僅通過(guò)一次接種就可對(duì)黃熱病產(chǎn)生終生保護(hù)。然而，并不是所有的病原體都可以作為活疫苗使用。有些病毒毒性太大，而另一些病毒天生就無(wú)法免疫。23,58這些情況需要將抗原傳遞到原病原體之外的策略?？乖梢詮牟≡w培養(yǎng)物中純化，也可以通過(guò)基因重組產(chǎn)生。另外,抗原肽的形式提供,可以提供的MHC molecules59或者他們可以采取遺傳物質(zhì)的形式(如DNA和RNA),可以翻譯回本地蛋白質(zhì)形式使用內(nèi)在的細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)機(jī)械body.60, 61。這些抗原與外部佐劑配合使用時(shí)稱為亞單位疫苗納米顆粒被發(fā)現(xiàn)是亞單位疫苗的優(yōu)良載體系統(tǒng)，在許多情況下，它們可以同時(shí)提供佐劑效果。這些特征使得納米顆粒配方疫苗在開(kāi)發(fā)新一代保護(hù)性疫苗時(shí)非常有吸引力。

相比之下，治療性疫苗的目的是通過(guò)使用疫苗的基本配方，即抗原和佐劑的組合，恢復(fù)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，以激發(fā)對(duì)各種慢性疾病的治療效果，如癌癥和自身免疫疾病，其中免疫反應(yīng)的失敗是一個(gè)根本原因。癌癥免疫療法包括激活免疫系統(tǒng)預(yù)防癌癥發(fā)展和/或治療癌癥發(fā)展。理想情況下，免疫細(xì)胞可以對(duì)特定的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向攻擊，而不會(huì)對(duì)正常組織造成損傷。通過(guò)這種方法，可以解決由轉(zhuǎn)移引起的原發(fā)和繼發(fā)腫瘤。癌癥疫苗屬于癌癥免疫治療大家族，其中還包括治療性單克隆抗體63種重組細(xì)胞因子，64種免疫檢查點(diǎn)抑制劑，65種過(guò)繼細(xì)胞治療。癌癥疫苗方法相對(duì)容易實(shí)施，這意味著它作為一種利用免疫系統(tǒng)進(jìn)行癌癥治療的有吸引力的方法脫穎而出。與化療和放療等常規(guī)治療方法相比，癌癥疫苗的其他好處是其低毒性和高特異性。目前癌癥疫苗的發(fā)展主要集中在提供個(gè)性化抗原的策略，以及改進(jìn)運(yùn)載工具和佐劑配方;后兩者的發(fā)展情況與保護(hù)性疫苗領(lǐng)域的情況非常相似。在許多自身免疫性疾病中，Treg損傷是一個(gè)常見(jiàn)的主題。在許多相關(guān)動(dòng)物模型中，Treg功能的重建被觀察到可以改善預(yù)后目前，自身免疫疾病的治療選擇僅限于非特異性免疫抑制劑，增加了感染或癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。誘導(dǎo)疾病特異性Treg抑制自身免疫的治療性疫苗的發(fā)展可能會(huì)徹底改變自身免疫疾病的治療。通過(guò)免疫誘導(dǎo)耐受一直被認(rèn)為是有可能的，因?yàn)檫^(guò)量免疫抗原的動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致抗原特異性的免疫耐受而不是耐藥性。在過(guò)量的情況下，胸腺組織可能獲得并隨后呈遞注射的抗原誘導(dǎo)Treg。這通常被認(rèn)為是這一現(xiàn)象背后的機(jī)制。然而，由于明顯的安全性和實(shí)用性，過(guò)量條件下的免疫不適合臨床應(yīng)用。另一種方法利用皮膚朗格漢斯細(xì)胞的耐受性誘導(dǎo)免疫耐受性。66,69這包括將mhc限制的自身抗原多肽注射到朗格漢斯細(xì)胞所在的真皮層，但在臨床試驗(yàn)中隨機(jī)觸發(fā)的自身免疫表明，這些真皮APCs可能采用非耐候性表型，使該策略不太可靠。

70 .獲得治療性免疫疾病疫苗的幾種方法，包括納米顆粒配方疫苗，正在積極發(fā)展中從本質(zhì)上講，納米顆粒能夠同時(shí)攜帶多種類型的貨物，從而允許免疫抑制藥物的聯(lián)合傳遞，從而可靠地確保耐生APC特征。為此，自身抗原與臨床可用的免疫抑制藥物71和臨床前耐受性信號(hào)通路配體72的聯(lián)合傳遞導(dǎo)致了自身免疫的抗原特異性抑制。在穩(wěn)態(tài)過(guò)程中，T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞之間的相互作用，通過(guò)閾下協(xié)同刺激提供抗原，導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)自身抗原無(wú)能為力11.最近，研究表明，修飾有MHC i -肽51和MHC ii -肽復(fù)合物50的納米顆?？梢阅M具有亞-抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞閾值co-stimulation。這為誘導(dǎo)免疫耐受提供了一種新的選擇。

疫苗接種途徑中的關(guān)鍵步驟:與納米顆粒相關(guān)的優(yōu)勢(shì)和挑戰(zhàn)

在誘導(dǎo)CD4+和CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)的疫苗接種途徑中有幾個(gè)關(guān)鍵步驟。它始于未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞捕獲抗原。樹(shù)突狀細(xì)胞是由造血干細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生的。然后它們進(jìn)入血液循環(huán)，到達(dá)組織，尋找抗原。與抗原一起捕獲的病原體和損傷相關(guān)的分子信號(hào)的處理導(dǎo)致它們的成熟和樹(shù)突狀細(xì)胞遷移到淋巴結(jié)。在那里，樹(shù)突狀細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用，共同呈現(xiàn)抗原和共刺激因子，并釋放細(xì)胞因子來(lái)激活T細(xì)胞(圖3)。

dc對(duì)抗原的捕獲

樹(shù)突狀細(xì)胞攝取抗原的常見(jiàn)機(jī)制有吞噬作用和巨胞吞噬作用這些是許多免疫細(xì)胞采取的方法，包括dc、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞73這兩種機(jī)制都在巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞清除微生物和樹(shù)突狀細(xì)胞收集抗原中發(fā)揮重要作用。大胞飲作用是細(xì)胞表面凸起物包圍周圍的液體，形成微米大小的大胞飲小體大量胞飲是自由溶解蛋白質(zhì)或肽抗原的主要攝取途徑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，幾十納米大小的小納米顆粒也可以通過(guò)這種內(nèi)吞途徑進(jìn)入免疫細(xì)胞對(duì)于較大的顆粒，如微生物和細(xì)胞碎片，內(nèi)化主要涉及沉積吞噬細(xì)胞沿靶細(xì)胞邊界的細(xì)胞膜，最終形成一個(gè)緊密包圍并內(nèi)化靶細(xì)胞的吞噬體。

據(jù)報(bào)道，攜帶納米顆粒的抗原(與基于小分子的抗原相比)具有更高的細(xì)胞吸收效率。對(duì)此現(xiàn)象的一種解釋是納米顆粒表面(具有特定的表面功能化或電荷調(diào)制)與細(xì)胞膜之間具有較高的親和力。例如，對(duì)帶負(fù)電荷的裸mRNA的攝取率小于1 / 10,000初始輸入分子采用表面帶正電荷的納米載體可顯著提高這些抗原的吸收(高達(dá)80-95%)。研究還發(fā)現(xiàn)，帶有dc特異性表面受體配體(如CD11c、CD40和DEC205)的納米載體的表面功能化也能有效地促進(jìn)它們被dc吸收。例如，用抗DEC-205抗體修飾的納米載體可以有效地將抗原傳遞給DEC-205陽(yáng)性的dc用抗體、多肽或受體配體修飾納米粒子的表面可以同時(shí)導(dǎo)致dc的靶向和激活。然而，體內(nèi)對(duì)受體靶向的反應(yīng)是物種特異性的，并且從動(dòng)物研究直接轉(zhuǎn)化到人類常常不是那么簡(jiǎn)單的。最近的兩項(xiàng)研究證實(shí)了受體靶向的巨大潛力和復(fù)雜性。在第一項(xiàng)研究中，Conniot和同事探索了甘露糖基化NPs用于癌癥疫苗的應(yīng)用84。與之前的研究一致，納米粒上的甘露糖功能導(dǎo)致通過(guò)甘露糖受體的dc靶向，增強(qiáng)了由納米粒攜帶的抗原和佐劑的傳遞，與非甘露糖基化對(duì)照相比，產(chǎn)生了更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。然而，對(duì)腫瘤微環(huán)境的詳細(xì)分析顯示，甘露糖基化納米顆粒免疫也導(dǎo)致了未預(yù)見(jiàn)到的髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的流入，這可能會(huì)否定對(duì)疫苗效力的影響。因此，研究團(tuán)隊(duì)將MDSC抑制劑ibrutinib納入免疫方法，并證明這種新的治療方法可以最佳地應(yīng)用甘露糖基化癌癥疫苗。在第二項(xiàng)研究中，研究了糖基化的HIV抗原以單體形式或齊聚成納米顆粒誘導(dǎo)體液反應(yīng)85。這些抗原通過(guò)甘露糖受體靶向APCs。單體和寡聚形式誘導(dǎo)了相似水平的卵泡輔助T細(xì)胞反應(yīng)，表明靶向樹(shù)突狀細(xì)胞的效率相似。然而，它們引起了不同程度的體液反應(yīng)。這些不同的體液反應(yīng)的原因可以追溯到引流淋巴結(jié)的濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞。這一有趣的結(jié)果表明，在受體識(shí)別過(guò)程中，不同類型的細(xì)胞可能有幾何或大小的要求，從而允許利用物理特性對(duì)目標(biāo)進(jìn)行微調(diào)。

用于細(xì)胞攝取的納米載體的最佳尺寸通常隨材料組成和細(xì)胞類型而變化。~ 100 nm的納米顆粒被認(rèn)為是最有利于樹(shù)突狀細(xì)胞攝取的。這種大小與樹(shù)突狀細(xì)胞的自然目標(biāo):病毒和細(xì)菌相匹配。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)納米顆粒的大小超過(guò)500 nm時(shí)，它們往往被DCs吸收效率較低，主要被巨噬細(xì)胞吞噬781。（開(kāi)題講解）

?

幾何形狀是一個(gè)高度研究的形態(tài)學(xué)參數(shù)與細(xì)胞攝取。由于許多基于聚合物和無(wú)機(jī)材料的納米顆粒可以以不同的尺寸和長(zhǎng)寬比合成，因此已經(jīng)用不同的細(xì)胞類型評(píng)估了幾何形狀對(duì)攝取的影響。87 - 90。棒狀納米粒子和長(zhǎng)橢球粒子的吞噬作用與球形納米粒子相似或不如球形納米粒子，而扁橢球粒子比球形納米粒子的吞噬作用更有效。88 - 90Niikura等比較了球形、棒狀和立方狀A(yù)u NPs對(duì)dc的吸收效率，發(fā)現(xiàn)棒狀A(yù)u NPs對(duì)dc的吸收效率略高。相反，立方體狀A(yù)u NPs的內(nèi)化效率最低。一般來(lái)說(shuō)，納米顆粒與質(zhì)膜的接觸面積越大，細(xì)胞膜上的NP錨定概率就越高;然而，NPs的國(guó)際化也依賴于膜皺褶的可能性，這是一個(gè)能量依賴的過(guò)程。92,93遵循類似的原則，柔軟的可變形納米顆粒可以提高吸收效率在最近的一份報(bào)告中，Xia等人證明了由PLGA穩(wěn)定的角鯊烯乳液制成的柔軟柔韌的微顆粒比固體PLGA微顆粒提供了3倍的抗原。94除吞噬作用外，已知納米顆粒系統(tǒng)通過(guò)其他胞吞作用途徑進(jìn)入細(xì)胞一般認(rèn)為，大小不超過(guò)200 nm的納米顆?？梢赃M(jìn)行網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。腔泡介導(dǎo)的攝取可能對(duì)顆粒大小有更嚴(yán)格的限制，因?yàn)榍慌菀蕾嚨膬?nèi)陷通常涉及顆粒。大于80nm然而，在文獻(xiàn)報(bào)告中存在差異，這些各自的大小可能取決于細(xì)胞系?？紤]到在體內(nèi)攝取納米顆粒，可能會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步的并發(fā)癥，因?yàn)椴煌募?xì)胞類型會(huì)爭(zhēng)奪有限的納米顆粒供應(yīng)。值得指出的是，某些內(nèi)吞途徑，如小泡介導(dǎo)的途徑，可以將吞噬的貨物引導(dǎo)到特定的細(xì)胞內(nèi)囊泡，97可能改變了納米顆粒所承擔(dān)的細(xì)胞內(nèi)加工途徑。因此，針對(duì)特定內(nèi)吞通路的NPs表面工程可能為疫苗設(shè)計(jì)提供新的機(jī)會(huì)。

基于納米顆粒的抗原傳遞的其他優(yōu)勢(shì)來(lái)自于納米顆粒和自由溶解抗原的藥代動(dòng)力學(xué)差異。自由溶解的抗原很容易以多種方式被消耗，主要是通過(guò)擴(kuò)散到體液和循環(huán)以及隨后的稀釋。相比之下，納米顆粒的生物分布很大程度上取決于它們的大小。我們知道小于5 nm的納米顆粒很容易通過(guò)腎系統(tǒng)退出循環(huán)，但那些較大的納米顆粒(20-200 nm)的循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)在循環(huán)中，更大尺寸的納米顆粒通常更有可能被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)捕獲，例如被肝臟Kupffer細(xì)胞脾臟的巨噬細(xì)胞捕獲。

對(duì)于某些疫苗的應(yīng)用來(lái)說(shuō)，特別重要的是納米顆粒在淋巴結(jié)中富集的可能性。這是很重要的，因?yàn)樵鰪?qiáng)的淋巴運(yùn)輸允許直接進(jìn)入淋巴樣節(jié)點(diǎn)的樹(shù)突狀細(xì)胞，增強(qiáng)B細(xì)胞對(duì)抗原的攝取和呈遞，增強(qiáng)體液反應(yīng)，28。圖4注射后，小納米顆粒有效地穿過(guò)淋巴上皮到達(dá)引流淋巴結(jié)。(a)共注射熒光團(tuán)標(biāo)記的25 nm和100 nm納米顆粒后小鼠尾部的熒光微淋巴管造影圖像。25 nm NPs比100 nm NPs更有效地進(jìn)入淋巴網(wǎng)絡(luò)。比例尺:1mm。(b)引流淋巴結(jié)的熒光顯微鏡圖像。24小時(shí)后，25 nm NPs比100 nm NPs更有效地到達(dá)淋巴結(jié)。這些納米顆粒被發(fā)現(xiàn)具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)效率99(圖4)。在這種效果的一種實(shí)現(xiàn)中，10納米，負(fù)載腫瘤抗原，研究發(fā)現(xiàn)，由合成高密度脂蛋白(sHDL)制成的圓盤(pán)狀納米顆粒具有有效的ln靶向傳遞，與自由溶解的抗原相比，可顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。100種抗原可能擴(kuò)散到體液中，并因其體積小(<2 nm)而被稀釋。

?

圖4注射后，小納米顆粒有效地穿過(guò)淋巴上皮到達(dá)引流淋巴結(jié)。(a)共注射熒光團(tuán)標(biāo)記的25 nm和100 nm納米顆粒后小鼠尾部的熒光微淋巴管造影圖像。25 nm NPs比100 nm NPs更有效地進(jìn)入淋巴網(wǎng)絡(luò)。比例尺:1mm。(b)引流淋巴結(jié)的熒光顯微鏡圖像。注射24小時(shí)后，25 nm NPs比100 nm NPs更有效地到達(dá)淋巴結(jié)。比例尺:200 μm。經(jīng)施普林格自然雜志許可，轉(zhuǎn)載自ref. 28

通過(guò)適當(dāng)?shù)募{米顆粒配方在注射部位保留抗原，也可以顯著增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)抗原的攝取和呈遞，在許多納米顆粒配方的情況下，形成增強(qiáng)免疫原性的基礎(chǔ)。（開(kāi)題報(bào)告）在組織中，大于200nm的納米顆粒被細(xì)胞外基質(zhì)有效地保留，因此它們向淋巴結(jié)的運(yùn)輸必須得到樹(shù)突狀細(xì)胞的幫助。也就是說(shuō)，它們?cè)谶M(jìn)入淋巴結(jié)之前需要被dc內(nèi)吞。聚集的抗原比自由溶解的抗原更有效的原因之一是在注射部位的保留。

如果想充分利用納米技術(shù)，成功地將抗原裝載到納米載體上是一個(gè)先決條件。能有效地將抗原傳遞到樹(shù)突狀細(xì)胞的顆粒載體。抗原有不同的形式，包括蛋白質(zhì)/多肽、DNA和mRNA，具有不同的化學(xué)和物理特性。這些生物聚合物在物理和化學(xué)性質(zhì)方面可能有很大的不同，因?yàn)樗鼈兊男蛄泻徒M成可以改變，使它們單獨(dú)應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性。裝載到納米顆粒上可以提供一個(gè)通用的平臺(tái)來(lái)處理不同的抗原。

表3總結(jié)了用于抗原裝載的不同類型的材料以及相關(guān)的疫苗接種效果。蛋白質(zhì)和多肽抗原可以被封裝成納米載體，通過(guò)電荷或化學(xué)作用與納米載體結(jié)合，或在納米載體表面吸收。DNA和mRNA固有地誘導(dǎo)強(qiáng)烈的MHC i介導(dǎo)的CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)，78102，這對(duì)癌癥疫苗的有效性至關(guān)重要。對(duì)于這些抗原，納米顆粒載體提供的保護(hù)對(duì)抗原在體內(nèi)傳遞很重要;事實(shí)上，納米載體的使用特別使信使rna抗原應(yīng)用于疫苗應(yīng)用成為可能，61作為mRNA，否則在細(xì)胞外空間rnase降解。與蛋白質(zhì)/多肽型抗原相比，將這些基于多核苷酸的抗原裝載到納米載體上需要額外的考慮，因?yàn)镈NA，尤其是mRNA在化學(xué)上是不穩(wěn)定的，當(dāng)它們被裝載到納米載體上時(shí)，它們無(wú)法在許多嚴(yán)苛的化學(xué)/物理操縱技術(shù)中存活。

?

脂基納米顆粒已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于各種納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用，為核苷酸抗原的負(fù)載提供了一個(gè)可行的解決方案。這些納米顆粒載體通常是用兩親性脂質(zhì)材料制備的，這些脂質(zhì)材料含有極性頭部基團(tuán)和非極性尾部帶正電荷的脂質(zhì)，比如DOTAP(1, 2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium丙烷）通常用于通過(guò)靜電相互作用包封多核苷酸抗原。這樣的封裝可以在不涉及苛刻過(guò)程的情況下完成。裝載多核苷酸抗原的其他載體選擇包括使用陽(yáng)離子聚合物，它們也通過(guò)靜電吸引封裝。例如，聚醚酰亞胺(PEI)用于艾滋病毒抗原編碼mRNA遞送，并報(bào)道了強(qiáng)烈的全身和黏膜艾滋病毒特異性免疫應(yīng)答。109上述抗原加載策略為非原位過(guò)程;即抗原的裝載發(fā)生在納米顆粒疫苗制備過(guò)程中(圖5a)。最近，出現(xiàn)了一種非常不同的方法，該方法可以在體內(nèi)注射為抗原捕獲量身定制的納米載體，而不需要預(yù)先裝載抗原。這些新型顆粒捕獲腫瘤抗原在腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡過(guò)程中釋放(圖5b)。

?

圖5納米顆粒劑型疫苗的裝填方案。(a)非原位:將預(yù)先制備的抗原(佐劑)裝入納米顆粒，然后將其注射到小鼠體內(nèi)，在此過(guò)程中，納米疫苗將被樹(shù)突狀細(xì)胞捕獲。(b)原位:在各種治療方法誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡過(guò)程中產(chǎn)生抗原。它們被注射到小鼠體內(nèi)的納米顆粒捕獲，形成一種能夠攝取DC的納米疫苗。

一些治療方法，如光動(dòng)力/光熱療法、放射療法和某些化療，現(xiàn)在已知會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡，釋放腫瘤相關(guān)抗原。關(guān)于細(xì)胞程序性死亡的生物學(xué)過(guò)程的詳細(xì)討論可以在最近的一篇綜述文章中找到這種原位抗原加載策略具有與采用遷地加載方案的傳統(tǒng)癌癥疫苗相比，具有成本效益和健壯性的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楹笳咝枰[瘤新抗原個(gè)性化以最大限度地提高疫苗效力。122因此，納米顆粒可以促進(jìn)免疫原性細(xì)胞死亡，并有效地捕捉抗原，這是一個(gè)巨大的研究興趣。例如，Min和同事開(kāi)發(fā)了基于plga的抗原捕獲納米粒(AC-NPs)，能夠通過(guò)化學(xué)或物理相互作用與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。他們發(fā)現(xiàn)這些AC-NPs可以促進(jìn)dc對(duì)腫瘤抗原的攝取和呈遞，從而導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞的活躍。在另一個(gè)例子中，Wang和同事使用磷脂穩(wěn)定的膠束納米顆粒傳遞吲哚菁綠，并通過(guò)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡和抗原釋放。腫瘤抗原被納米顆粒表面的馬來(lái)酰亞胺在原位捕獲，這種方法在小鼠模型中證明了對(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥的治療效果。

由樹(shù)突狀細(xì)胞呈遞抗原

dc獲得的抗原通過(guò)兩種不同的途徑進(jìn)行遞呈:MHC II抗原遞呈途徑用于CD4+ T細(xì)胞活化;以及CD8+的MHC I表達(dá)途徑T細(xì)胞激活。圖6是主要MHC I和II通路的示意圖。

?

圖6不同抗原遞呈機(jī)制;注:吞噬體交叉表達(dá)途徑，一個(gè)涉及抗原結(jié)合到MHC I復(fù)合體再循環(huán)到吞噬體的次要機(jī)制，在本例中不包括。

MHC II分子僅由樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞表達(dá);其中，樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)責(zé)遷移到淋巴結(jié)，與T細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致適應(yīng)性反應(yīng)的啟動(dòng)和傳播MHC II分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中以膜結(jié)合復(fù)合物的形式合成，其不變鏈(II)阻斷了MHC II肽結(jié)合位點(diǎn)。MHC II-Ii復(fù)合體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)高爾基體運(yùn)送到質(zhì)膜，然后通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用返回。MHC I分子廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物體內(nèi)所有有核細(xì)胞中。MHC I途徑主要表現(xiàn)為來(lái)自細(xì)胞內(nèi)抗原(胞漿蛋白和膜蛋白)的多肽，這些多肽可以自生或由病毒或納米顆粒DNA/mRNA載體從外部引入。抗原的肽段是通過(guò)胞質(zhì)蛋白酶體消化相應(yīng)的蛋白抗原而獲得的。這些肽段被抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔，并與MHC結(jié)合。這包括蛋白質(zhì)抗原從內(nèi)溶酶體腔室到胞質(zhì)腔室的運(yùn)輸另一個(gè)次要的交叉呈遞途徑涉及膜結(jié)合小泡中的抗原加工，如吞噬體，使用MHC II途徑中相同的抗原加工酶，并與回收到這些小泡中的MHC I復(fù)合物結(jié)合。由此產(chǎn)生的MHC i -肽復(fù)合物然后被運(yùn)送到質(zhì)膜進(jìn)行抗原呈遞，其方式類似于MHC II途徑交叉表現(xiàn)主要由CD8+ DC亞群完成。

常見(jiàn)的納米顆粒載體系統(tǒng)通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞;一個(gè)直接的結(jié)果是，它們駐留在膜結(jié)合的小泡中(即內(nèi)溶酶體)，目的是進(jìn)行抗原處理和MHC II呈遞。結(jié)合以上討論的組織保留和增強(qiáng)細(xì)胞攝取的影響，納米顆粒配方有可能增強(qiáng)MHC II蛋白或肽抗原的呈現(xiàn)，以激活CD4+ T細(xì)胞。

相反，對(duì)于以mRNA形式傳遞的抗原，需要轉(zhuǎn)位到細(xì)胞液(轉(zhuǎn)染)才能轉(zhuǎn)譯為蛋白質(zhì)，MHC I途徑是抗原提呈的主要方式(詳細(xì)內(nèi)容如下)。MHC II表達(dá)增強(qiáng)已成為與mRNA抗原相關(guān)的一個(gè)重要問(wèn)題。

最近已經(jīng)通過(guò)序列水平的修改實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)ER易位，并在抗原處理室中定位翻譯后的抗原，用于MHC II呈遞。一個(gè)顯著的ER易位信號(hào)的例子是由Sahin集團(tuán)開(kāi)發(fā)的MITD信號(hào)序列。

mRNA或DNA抗原被使用時(shí)，它們?cè)跇?shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞液中被翻譯成編碼蛋白是隨后抗原呈遞的首要條件(圖6)。這需要從細(xì)胞外空間轉(zhuǎn)染一個(gè)多核苷酸到細(xì)胞液中。就DNA而言，它也必須進(jìn)入細(xì)胞核，才能轉(zhuǎn)錄成mrna。只有在有絲分裂時(shí)，核膜的解體和細(xì)胞核的重組才允許抗原進(jìn)入細(xì)胞核，這種DNA的核運(yùn)輸才有效否則，必須采用復(fù)雜的策略，如將含有細(xì)胞核定位信號(hào)的信號(hào)肽化學(xué)偶聯(lián)到DNA，以提高核轉(zhuǎn)運(yùn)效率。使用病毒轉(zhuǎn)染載體可以增強(qiáng)核轉(zhuǎn)運(yùn)，但這也可能引起危及生命的免疫病理或增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)由于dc在體內(nèi)不分裂，DNA從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的運(yùn)輸仍然是DNA疫苗開(kāi)發(fā)的一個(gè)艱巨挑戰(zhàn)。

與DNA相比，mRNA抗原直接在細(xì)胞質(zhì)中工作，不需要核進(jìn)入許多以納米顆粒為基礎(chǔ)的策略已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，使mrna的胞質(zhì)傳遞成為可能。一種策略是利用質(zhì)子海綿效應(yīng)，使被內(nèi)吞的納米顆粒通過(guò)囊泡逸出進(jìn)行胞質(zhì)輸送這涉及到一個(gè)帶正電荷的載體，它可以在核內(nèi)體酸化過(guò)程中吸收質(zhì)子，導(dǎo)致滲透腫脹和隨后的核內(nèi)體破壞。聚醚酰亞胺(PEI)109和聚β氨基酯(PBAE)136是質(zhì)子海綿效應(yīng)的常見(jiàn)材料體系。

?

另一種胞質(zhì)遞送多核苷酸抗原的策略是使用陽(yáng)離子脂基載體。陽(yáng)離子脂質(zhì)和陰離子內(nèi)體膜之間的靜電相互作用可以導(dǎo)致囊泡膜的破壞，從而允許細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送所攜帶的貨物。另外，可以配制陽(yáng)離子脂基載體直接與質(zhì)膜融合，通過(guò)細(xì)胞表面將多核苷酸物質(zhì)釋放到胞漿中。陽(yáng)離子脂類，如lipofectamine，已在商業(yè)上獲得，它們的高RNA轉(zhuǎn)染效率已得到充分證明然而，一些研究表明，陽(yáng)離子脂基給藥系統(tǒng)與體內(nèi)毒性有關(guān)。幾種方法已經(jīng)被用來(lái)降低陽(yáng)離子脂類的毒性。一種是通過(guò)添加中性的輔助脂質(zhì)，如1,2-二油酰- sn甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，來(lái)降低納米顆粒配方中陽(yáng)離子脂質(zhì)的比例。輔助脂質(zhì)在核內(nèi)體逃逸過(guò)程中也起著重要作用另一種降低毒性的方法是用弱陽(yáng)離子脂類取代強(qiáng)陽(yáng)離子脂類，如1,2-二油酰-3-二甲基-氨-丙烷(DODAP)。含有透明質(zhì)酸層的脂質(zhì)納米顆粒也被發(fā)現(xiàn)能降低體內(nèi)毒性。在其他納米顆粒表面修飾陽(yáng)離子脂質(zhì)已被發(fā)現(xiàn)能夠?qū)崿F(xiàn)胞質(zhì)傳遞。Kim等人將融合脂質(zhì)體涂在多孔硅NPs (pSiNPs)表面。144他們證明，融合型pSiNPs通過(guò)融合型攝取直接到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，而非融合型pSiNPs通過(guò)內(nèi)吞作用然后定位于細(xì)胞質(zhì)。因此，直接胞質(zhì)釋放的融合基因途徑比內(nèi)體攝取途徑獲得更高的轉(zhuǎn)染效率。這種遞送策略避免了內(nèi)吞途徑，并阻止了mRNA抗原在核內(nèi)體中的降解。

由于蛋白質(zhì)和多肽的胞質(zhì)遞送是交叉呈遞的關(guān)鍵步驟(圖6)，可以利用通過(guò)核內(nèi)體逃逸或膜融合的胞質(zhì)遞送的納米顆粒配方來(lái)增加蛋白質(zhì)和多肽抗原的MHC I呈遞。與信使rna的胞質(zhì)傳遞類似，陽(yáng)離子脂質(zhì)s145和聚合體146已被用于提高M(jìn)HC I蛋白和肽抗原的表達(dá)。另一個(gè)既定的策略是調(diào)整納米顆粒載體的降解性。147 .在細(xì)胞水平上，調(diào)節(jié)納米顆粒的降解性可以導(dǎo)致抗原被定向到不同的內(nèi)溶酶體間室，使抗原呈偏向MHC I或MHC II途徑動(dòng)物研究表明，在癌癥和牛痘病毒模型中，效果有所提高。

如何誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答以預(yù)防癌癥和病毒感染是一個(gè)重要的課題。為此，多年來(lái)開(kāi)發(fā)的各種策略已致力于改善MHC I的納米顆粒攜帶抗原的呈現(xiàn)。這些包括使用MHC i限制性多肽和mRNA抗原，以及交叉表達(dá)增強(qiáng)策略(包括受體靶向和調(diào)整納米顆粒特性，如上文所述)。目前，上述策略均未顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。由于每種策略都是為特定類型的納米顆粒設(shè)計(jì)量身定制的，在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，這些策略可能仍然是開(kāi)放的選擇，允許不同的納米疫苗設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)有用的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答。

樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟

未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞在主動(dòng)采集環(huán)境中抗原的同時(shí)進(jìn)行間質(zhì)巡邏它們遷移到淋巴結(jié)，也就是T細(xì)胞所在的地方，抗原呈遞是通過(guò)向成熟表型的轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)的。這種吞噬細(xì)胞中樹(shù)突狀細(xì)胞特有的表型變化被稱為成熟。

未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞在存在促炎細(xì)胞因子、1075個(gè)模式識(shí)別受體(PRR)配體、23個(gè)免疫刺激外泌體、150個(gè)或補(bǔ)充31或免疫球蛋白151修飾顆粒的情況下可以轉(zhuǎn)變成成熟的表型。這些刺激物引起的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，從而導(dǎo)致表型改變，包括由于細(xì)胞資源的重新分配用于遷移，表面粘附性的喪失，C-C趨化因子受體(CCR7)的表達(dá)用于淋巴結(jié)定向粘附。這導(dǎo)致成熟樹(shù)突狀細(xì)胞從組織主動(dòng)遷移到淋巴系統(tǒng)。此外，NF-κ b介導(dǎo)的成熟導(dǎo)致了MHC II合成的上調(diào)和MHC II復(fù)合物從內(nèi)溶酶體室重新分布到質(zhì)膜上，增強(qiáng)了MHC II向CD4+ T細(xì)胞的呈遞。在成熟過(guò)程中，伴隨這些步驟的還有細(xì)胞膜上共刺激分子的表達(dá)130和細(xì)胞因子生產(chǎn)能力的增加73，這兩者都是形成CD4+和CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)和記憶的必要條件。

在穩(wěn)定狀態(tài)下，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)自發(fā)的Iκκβ轉(zhuǎn)錄因子激活而成熟。153 . i κκβ介導(dǎo)的成熟導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞淋巴結(jié)遷移，促進(jìn)外周對(duì)自身抗原的耐受性因此，通過(guò)NF-κB而不是Iκκβ誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，激活樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)癌癥疫苗的保護(hù)和治療效果至關(guān)重要。對(duì)于治療性癌癥疫苗，刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟尤其重要，因?yàn)闃?shù)突狀細(xì)胞上的共刺激分子可以重新激活因長(zhǎng)期暴露于腫瘤抗原而耗盡的T細(xì)胞41。

使用納米粒子聯(lián)合遞送PRR配體和抗原是誘導(dǎo)抗原呈遞DC成熟的一種流行策略。為疫苗應(yīng)用開(kāi)發(fā)的大多數(shù)常見(jiàn)PRR配體已被證明與納米顆粒配方很好地工作，提高免疫應(yīng)答和疫苗效力。其中包括TLR3配體聚肌苷-聚胞苷酸(poly(I:C))，154 TLR4配體單磷酸脂質(zhì)A (MPLA)，56 TLR7/8配體咪喹mod56和TLR9配體CpG寡核苷酸。協(xié)同作用允許多個(gè)PRR配體使用一個(gè)單一的納米顆粒共遞送已經(jīng)被報(bào)道在設(shè)計(jì)PRR配體的納米載體時(shí)，人們應(yīng)該注意到不同的PRR家族成員位于不同的細(xì)胞隔間。這意味著納米顆粒的設(shè)計(jì)需要滿足特定的傳遞要求，例如核苷酸結(jié)合寡聚域受體(NLR)配體的細(xì)胞內(nèi)傳遞，TLR4配體的細(xì)胞表面?zhèn)鬟f，以及TLR3、7/8和9配體的內(nèi)體釋放。此外，顆粒設(shè)計(jì)應(yīng)考慮幾何要求，特別是尺寸要求，以最佳刺激內(nèi)體受體，如TLR9,25,26。

另一方面，可以通過(guò)不同的方式獲得多模態(tài)納米顆粒配方。一些納米顆粒由于其固有的化學(xué)/物理參數(shù)而具有固有的佐劑性(表3)。已知許多納米顆粒系統(tǒng)能內(nèi)在地刺激炎癥小體反應(yīng)這些通常是具有尖銳邊緣的顆粒，如鋁和各種可以破壞吞噬體膜穩(wěn)定性的晶體顆粒材料。事實(shí)上，明礬常被用作佐劑。對(duì)于市場(chǎng)上的疫苗，62雖然其納米顆粒形態(tài)尚未被有意識(shí)地強(qiáng)調(diào)。具有尖表面的氧化鈦顆粒(圖7a)也被證明可以刺激炎癥小體反應(yīng)，觸發(fā)DC成熟，并增強(qiáng)疫苗在流感防護(hù)和腫瘤減少方面的效果。

?

近年來(lái)，機(jī)械力被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)中細(xì)胞信號(hào)傳遞的重要調(diào)節(jié)因子據(jù)此，可變形性被認(rèn)為是佐劑效應(yīng)的另一個(gè)因素。Xia等人基于PLGA納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液體系設(shè)計(jì)了柔韌性的微粒，用于裝載抗原94(圖7b)，測(cè)試了納米顆粒的變形性對(duì)免疫反應(yīng)的影響。增強(qiáng)的免疫反應(yīng)部分歸因于柔韌顆粒刺激DC成熟，而非非柔韌顆粒。佐劑性也可能來(lái)自于納米顆粒表面的特殊化學(xué)性質(zhì)。例如，Luo等人發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子聚合物基納米顆粒功能化azepanyl可以刺激干擾素基因(STING)家族細(xì)胞內(nèi)受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗原的同時(shí)傳遞和樹(shù)突狀細(xì)胞的活化。使用雜環(huán)胺配體的同樣的STING激活策略也被需要強(qiáng)調(diào)的是，na?ve CD4+ T細(xì)胞分化為效應(yīng)T輔助細(xì)胞的前提是且僅當(dāng)樹(shù)突狀細(xì)胞在病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)、損傷相關(guān)分子模式(DAMP)或細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的信號(hào)下同時(shí)呈現(xiàn)同源抗原。如果沒(méi)有這樣的信號(hào)提供，na?ve CD4+ T細(xì)胞認(rèn)為抗原是自源的，并進(jìn)入無(wú)能狀態(tài)15這是病原體和腫瘤細(xì)胞用來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的主要漏洞之一。應(yīng)用于脂基納米粒的mRNA傳遞，以增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

細(xì)胞毒性T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞活化

細(xì)胞毒性或CD8+ T細(xì)胞識(shí)別MHC I復(fù)合體上的抗原肽并進(jìn)行激活。它們利用分泌的穿孔素和顆粒酶或fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑中的細(xì)胞表面CD95L誘導(dǎo)感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞死亡CD4+ T輔助細(xì)胞對(duì)CD8+ T細(xì)胞的輔助作用是細(xì)胞毒性T細(xì)胞最佳活化所必需的然而，也有報(bào)道稱，通過(guò)適當(dāng)?shù)腜RR配體(如poly(I:C))激活DCs，可以在沒(méi)有CD4+ T輔助細(xì)胞的情況下充分激活CD8 T細(xì)胞。

它們還可以進(jìn)一步細(xì)分為3個(gè)特征明確的亞型，每一個(gè)亞型都專門(mén)針對(duì)一組特定的病原體。表4列出了它們的主要特點(diǎn)。在MHC II激活后，na?ve CD4+ T細(xì)胞分化(或極化)為不同TH細(xì)胞亞型是由dc提供的細(xì)胞因子和共刺激分子譜決定的。表4列出了驅(qū)動(dòng)TH細(xì)胞極化成相應(yīng)亞型的感染因子(dc刺激和先天免疫系統(tǒng)刺激)。還列出了涉及的PRR子集和刺激極化過(guò)程的細(xì)胞因子。然后，每個(gè)TH細(xì)胞亞型產(chǎn)生一組特征性的效應(yīng)細(xì)胞因子，這些效應(yīng)細(xì)胞因子作用于一系列附屬細(xì)胞，從而對(duì)感染因子產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。

?

以抗病毒TH1反應(yīng)為例，TH細(xì)胞發(fā)揮的中央?yún)f(xié)調(diào)功能得到了最好的證明病毒感染驅(qū)使CD4+ T細(xì)胞極化成TH1亞型。這一過(guò)程始于樹(shù)突狀細(xì)胞的prr(如TLR3, 7/8或9)檢測(cè)病毒RNA和DNA。在識(shí)別這些病毒PAMPs后，樹(shù)突狀細(xì)胞被激活并成熟。被感染者分泌的I型干擾素促進(jìn)了成熟過(guò)程。組織細(xì)胞。這導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞在向na?ve CD4+ T細(xì)胞遞呈抗原時(shí)共刺激因子的上調(diào)和IL-12的釋放。IL-12驅(qū)動(dòng)活化的CD4+ T細(xì)胞分化，采用TH1極化。然后TH1細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ， IFNγ傳播一系列抗病毒反應(yīng):在感染細(xì)胞上，IFNγ驅(qū)動(dòng)MHC I呈遞通路的上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別和殺死感染細(xì)胞。它還誘導(dǎo)抗病毒基因的表達(dá)，以抑制病毒在感染細(xì)胞中的復(fù)制。IFNγ增強(qiáng)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體用于病毒中和。此外，IFNγ促進(jìn)NK細(xì)胞活性，以協(xié)助清除感染細(xì)胞，并作用于巨噬細(xì)胞，以促進(jìn)清除感染細(xì)胞碎片。IFNγ也通過(guò)上皮細(xì)胞誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)招募中性粒細(xì)胞。這種TH細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子分泌協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)的一般主題在對(duì)抗寄生蟲(chóng)感染的TH2極化和對(duì)抗細(xì)菌感染的TH17極化中得到了很好的保存。

除了細(xì)胞因子外，成熟樹(shù)突狀細(xì)胞上的共刺激分子已知在CD4+ T輔助細(xì)胞的激活中發(fā)揮重要作用共刺激分子CD48、CD58、CD70、CD80、CD86和LIGHT促進(jìn)na?ve CD4+ T細(xì)胞活化為效應(yīng)T輔助細(xì)胞。CD70和LIGHT對(duì)TH1極化很重要，而SLAM、TIM和CD30L對(duì)TH2極化很重要。在它們的生命周期結(jié)束時(shí)，一部分效應(yīng)T細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞，在隨后的抗原遭遇中提供回憶(或二次)反應(yīng)回憶反應(yīng)的強(qiáng)度和記憶存活的時(shí)間長(zhǎng)度通常與細(xì)胞因子和共刺激分子刺激的強(qiáng)度有關(guān)。與任何相關(guān)的體積和表面積納米系統(tǒng)提供一個(gè)自然平臺(tái)co-delivery抗原和各種形式的分子佐劑,TLR配體等近幾十年來(lái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)而持久的memory.62。納米粒子協(xié)同遞送抗原和分子配體的優(yōu)勢(shì)在于其到達(dá)目標(biāo)樹(shù)突狀細(xì)胞的空間和時(shí)間重疊，允許同時(shí)處理和相關(guān)的T細(xì)胞激活。

在沒(méi)有納米顆粒載體的情況下，分子配體與抗原的共傳遞通常是通過(guò)分子配體與抗原的化學(xué)偶聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。雖然這種方法有它自己的優(yōu)點(diǎn)，相同分子配體和抗原的納米顆粒配方可以提供類似的結(jié)果，但在微調(diào)配方方面具有更大的靈活性通過(guò)調(diào)整納米粒子參數(shù)和配體組成。

事實(shí)上，由于多重功能在空間和時(shí)間上的重疊，通過(guò)納米顆粒載體的共遞可以顯著改善免疫反應(yīng)5。這已經(jīng)在體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)中被證明，許多不同的納米顆粒配方，而不管給藥途徑。25,100,148,149,163,164。例如，共同遞送TLR配體的協(xié)同作用比同一配體的共同給藥的反應(yīng)強(qiáng)得多，56因?yàn)楹笠环N方法由于藥代動(dòng)力學(xué)的不同，不能保證TLR配體在同一位置同時(shí)可用。在最近的一項(xiàng)研究中，Kuai等人使用合成高密度脂蛋白(sHDL)納米片共同遞送肽抗原和佐劑CpG.100與相同成分的物理混合物相比，納米盤(pán)納米顆粒誘導(dǎo)了更高水平的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)(圖8)。

?

圖8在合成高密度脂蛋白(sHDL)納米片上共遞抗原(Ags)和CpG佐劑可誘導(dǎo)強(qiáng)抑腫瘤。左上角:納米盤(pán)納米顆粒的制備和結(jié)構(gòu)示意圖;sHDL，高密度脂蛋白;左下:納米顆粒的透射電子顯微鏡成像顯示納米圓盤(pán)狀形態(tài);比例尺，100nm;右圖:與不進(jìn)行治療和抗原和佐劑的物理混合治療相比，使用sHDL-multiAgs/CpG納米片的動(dòng)物免疫能強(qiáng)烈抑制腫瘤生長(zhǎng)。

結(jié)論與未來(lái)展望

納米技術(shù)提供了有用的工具，以了解免疫系統(tǒng)的基本工作原理分割方式，使精確和獨(dú)立的控制材料參數(shù)，可能有影響的免疫過(guò)程。目前免疫學(xué)研究的趨勢(shì)是在亞微米水平上從力學(xué)特性和幾何排列的角度來(lái)處理免疫細(xì)胞的相互作用，納米技術(shù)將在免疫學(xué)的未來(lái)發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。雖然合理的疫苗開(kāi)發(fā)高度依賴于對(duì)免疫系統(tǒng)的機(jī)制理解，但通過(guò)將納米技術(shù)應(yīng)用于免疫學(xué)研究而獲得的知識(shí)無(wú)疑將轉(zhuǎn)化為疫苗開(kāi)發(fā)的新戰(zhàn)略。

疫苗的工作機(jī)制需要結(jié)合不止一種功能，即必須同時(shí)存在抗原和佐劑?？乖妥魟┒加胁煌男问剑⒖赡軆A向于特定的傳遞位點(diǎn)。在這方面，納米顆粒能夠安全適應(yīng)多種功能，并提供多種策略來(lái)滿足特定的交付要求。PRR配體的共遞是納米顆粒疫苗最早的突破之一，56并且仍然是大多數(shù)納米顆粒疫苗實(shí)施策略中不可或缺的一部分。增強(qiáng)效力的疫苗已經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)和驗(yàn)證。在許多情況下，這種增強(qiáng)來(lái)自于安全裝載貨物(抗原和佐劑)，避免它們?cè)谘貉h(huán)系統(tǒng)中迅速降解，納米顆粒和樹(shù)突狀細(xì)胞之間的相互作用改善了抗原的吸收。值得指出的是，傳統(tǒng)的非原位加載策略在很大程度上依賴于有效抗原的可用性，而這種抗原的加工可能是昂貴的。相比之下，最近開(kāi)發(fā)的用于癌癥疫苗的原位抗原加載策略已經(jīng)顯示出了巨大的潛力，但如何優(yōu)化納米顆粒載體的特異性抗原生成和捕獲能力的關(guān)鍵問(wèn)題仍然是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。被裝載貨物的觸發(fā)和/或可編程交付是納米顆粒配方的一個(gè)獨(dú)特特點(diǎn)，并已廣泛應(yīng)用于納米藥物設(shè)計(jì)的廣泛治療應(yīng)用。然而，在納米顆粒配方疫苗的情況下，這種策略很少被探索，盡管它顯然很重要;例如，抗原和佐劑傳遞的時(shí)間順序是至關(guān)重要的，因?yàn)樽魟?huì)促進(jìn)DC的成熟，成熟的DC不再傾向于抗原吸收。

納米顆粒配方疫苗研究最多的方面之一是納米顆粒本身的佐劑效應(yīng)。除了化學(xué)方面的例子，納米顆粒的許多物理特性已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的佐劑效應(yīng)。例如，通過(guò)納米顆?？煞纸庑哉{(diào)節(jié)的MHC I呈現(xiàn)增強(qiáng)已被應(yīng)用并在各種需要強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的保護(hù)和治療模型中得到驗(yàn)證。然而，這些免疫調(diào)節(jié)現(xiàn)象背后的生物學(xué)過(guò)程目前還沒(méi)有完全了解。具有鋒利邊緣的納米顆?？梢云茐膬?nèi)溶酶體結(jié)構(gòu)，從而引發(fā)炎癥小體反應(yīng)已知可提高疫苗的功效。這些納米顆粒系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制可能會(huì)改進(jìn)疫苗的設(shè)計(jì)。另一方面，值得指出的是，在疫苗接種的關(guān)鍵免疫成分中，操縱MHC II呈遞是一個(gè)很大程度上被忽視的方向?；诩{米顆粒的新策略的應(yīng)用可能提供了對(duì)MHC II呈遞調(diào)節(jié)的自然工作機(jī)制的早該洞察，并開(kāi)辟了增強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有疫苗應(yīng)答的新方法。體液免疫是一個(gè)非常有趣的話題，因?yàn)樗窃S多疫苗對(duì)抗病原體的關(guān)鍵保護(hù)關(guān)聯(lián)。體液反應(yīng)的發(fā)展是一個(gè)包含多個(gè)步驟和細(xì)胞成分的過(guò)程。就目前已知的關(guān)鍵步驟而言，它包括:(1)卵泡輔助T細(xì)胞(TFH)的發(fā)育;(2)抗原捕獲和B細(xì)胞活化;(3)形成生發(fā)中心;(4) B細(xì)胞類切換;(5)親和成熟，B細(xì)胞、TFH細(xì)胞和濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞(FDCs)參與了這一過(guò)程。關(guān)于這些生物過(guò)程的進(jìn)一步討論可以在一些深入的綜述中找到。166 - 168。

通過(guò)納米顆粒配方的抗原增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)是一個(gè)被充分證明的和可重復(fù)的現(xiàn)象，并且已經(jīng)建立了許多通過(guò)納米顆粒配方增強(qiáng)體液免疫的標(biāo)準(zhǔn)。這些都是在本文中提到的，包括:(1)最佳的納米顆粒尺寸(~ 40 nm的直徑);(2)抗原表面以重復(fù)的幾何圖案裝飾;(3)抗原與分子佐劑共遞，比如TLR配體。然而，在細(xì)胞水平上解釋這些標(biāo)準(zhǔn)的潛在機(jī)制尚不完全清楚。例如，高效的淋巴運(yùn)輸被認(rèn)為是使用小納米顆粒增強(qiáng)免疫反應(yīng)的原因。從實(shí)驗(yàn)性癌癥和病毒納米疫苗的經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，我們確信，小的、靶向淋巴結(jié)的納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)DC-T細(xì)胞軸增強(qiáng)T細(xì)胞的反應(yīng)。但是這些納米顆粒與B細(xì)胞之間的相互作用，以及與fdc之間的相互作用是否有作用呢?目前，由于B細(xì)胞對(duì)抗原在納米顆粒表面的幾何排列的敏感性，許多相關(guān)的觀察結(jié)果被掩蓋了。同樣，許多涉及抗原幾何形狀的實(shí)驗(yàn)也沒(méi)有考慮到抗原大小的差異。更復(fù)雜的是，一些研究表明，抗原的翻譯后糖基化狀態(tài)可以影響細(xì)胞類型的參與。了解npenhenhanced體液反應(yīng)的基礎(chǔ)機(jī)制，可以為進(jìn)一步改進(jìn)納米疫苗和真正合理的體液免疫疫苗設(shè)計(jì)提供見(jiàn)解。這將給未來(lái)的研究人員帶來(lái)挑戰(zhàn)，可能需要更多受控的體外實(shí)驗(yàn)來(lái)檢查納米顆粒和相關(guān)細(xì)胞類型之間的相互作用，以及允許測(cè)試關(guān)鍵步驟子集的體內(nèi)模型。雖然大多數(shù)研究都集中在納米顆粒和樹(shù)突狀細(xì)胞之間的相互作用上，但目的是通過(guò)使用納米粒子模擬真實(shí)的病原體，調(diào)節(jié)DCs和T細(xì)胞之間的通信的努力較少。在這方面，人工抗原提呈細(xì)胞在免疫學(xué)研究和納米疫苗開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用特別有趣。然而，目前的aAPC模型僅限于表面受體之間的相互作用，如MHC-TCR，以及共刺激/共抑制的相互作用。然而，天然的DC-T細(xì)胞通訊也涉及可溶性因子(例如dc釋放的細(xì)胞因子)。將目前的aAPC模型與能夠以可控方式釋放信號(hào)分子的納米顆粒相結(jié)合，可能會(huì)以更接近的方式模擬DC-T細(xì)胞通信，從而更好地理解所涉及的生物過(guò)程。aAPC研究的未來(lái)前景將在很大程度上依賴于分子生物學(xué)家和材料科學(xué)家的協(xié)同投入。41 .由于aAPCs的構(gòu)建需要微克高純度和高活性的蛋白質(zhì)，因此要超越商用的MHC-TCR和各種表面因子結(jié)合抗體，需要分子生物學(xué)家在dc和T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的無(wú)數(shù)表面信號(hào)分子的制備。

aAPC研究的未來(lái)前景將在很大程度上依賴于分子生物學(xué)家和材料科學(xué)家的協(xié)同投入。41 .由于aAPCs的構(gòu)建需要微克高純度和高活性的蛋白質(zhì)，因此要超越商用的MHC-TCR和各種表面因子結(jié)合抗體，需要分子生物學(xué)家在dc和T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的無(wú)數(shù)表面信號(hào)分子的制備。關(guān)于膜蛋白的制備的詳細(xì)討論可在別處找到與此同時(shí)，材料科學(xué)家設(shè)計(jì)的納米顆粒模型可以作為表面蛋白質(zhì)特定幾何排列的基質(zhì)，或允許可控的力學(xué)特性，將允許對(duì)與免疫相互作用的幾何和力學(xué)要求相關(guān)的觀察和推測(cè)進(jìn)行測(cè)試。有了aAPCs, dc和T細(xì)胞之間的體內(nèi)通信可以直接和系統(tǒng)地研究，這為超越kn更高效的疫苗開(kāi)發(fā)鋪平了道路。

?

?

?

Nanoparticles (NPs) are gradually becoming a mature platform for antigen delivery with multivalency and increased size, and recombinant expression of antigenbearing nanoparticles has become a new challenge for vaccine development due to increased structural complexity during nanoparticle assembly (38-40). Since covalent protein conjugation has been widely used in protein modification, we adopted a similar strategy to construct S1 nanoparticles (41-43).

納米顆粒(NPs)正逐漸成為一種成熟的多價(jià)、增大尺寸的抗原傳遞平臺(tái)，由于納米顆粒組裝過(guò)程中結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性增加，攜帶抗原的納米顆粒的重組表達(dá)已成為疫苗開(kāi)發(fā)的新挑戰(zhàn)（38-40）。由于共價(jià)蛋白偶聯(lián)在蛋白質(zhì)修飾中得到廣泛應(yīng)用，我們采用類似的策略構(gòu)建S1納米顆粒（41-43）。

?

?