寫在前面

????????今天推薦的是由以色列海法理工學(xué)院生物系團隊在2020年4月3日發(fā)表于EMBO Reports（IF：8.210，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Shenhav Cohen教授，研究表明長時間饑餓狀態(tài)下，USP1通過介導(dǎo)Akt的去泛素化抑制PI3K-Akt級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

研究背景

????????PI3K-Akt-FoxO-mTOR信號通路是控制所有細胞生長和代謝的中樞通路。IGF-I或胰島素激活該通路可促進細胞分裂，相反，抑制這一途徑會降低細胞存活率并導(dǎo)致肌肉萎縮。PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心是絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，它是細胞表面受體傳遞生長和生存信號不可或缺的通道。Akt的失調(diào)會導(dǎo)致多種疾病，包括癌癥、胰島素抵抗和肌肉萎縮等。Akt的活性在細胞中受到嚴格調(diào)控，PDK-1和mTORC2激酶分別在T308和S473上磷酸化Akt。Akt在這些殘基上的磷酸化被認為是限速的，也是最大程度激活A(yù)kt的必要條件。另一方面，Akt磷酸化之前的泛素化調(diào)控也是PI3K-Akt活性所必需的。

????????USP1是半胱氨酸蛋白酶USP家族的一員，它通過去泛素化作用來逆轉(zhuǎn)蛋白修飾。USP1最具特色的功能是在細胞核中作為DNA損傷應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子，并作為某些轉(zhuǎn)錄因子的負調(diào)節(jié)因子阻止細胞分化。最近的研究表明，USP1還能通過促進胰腺β細胞的凋亡在糖尿病中起作用。此前發(fā)現(xiàn)一種USP1基因敲除的小鼠有多種發(fā)育缺陷，包括骨質(zhì)減少、圍產(chǎn)期致死、雄性不育、染色體不穩(wěn)定和Fanconi貧血。雖然USP1在DNA修復(fù)機制中的重要作用已被充分證明，但其在調(diào)節(jié)代謝和生長方面的確切功能尚不清楚。

摘要部分

????????研究發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶USP1可以去除Akt激酶上K63連接的多泛素鏈，從而抑制長時間饑餓時小鼠肌肉中的PI3K-Akt-FoxO信號。作者通過DUB篩選平臺確定了USP1是Akt的直接DUB。研究表明，小鼠肌肉中USP1的缺失促進了禁食期間Akt的泛素化、PI3K-Akt-FoxO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及葡萄糖攝取。作者通過免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定出Dab2、TSC1/TSC2和PHLPP1為USP1的結(jié)合蛋白。饑餓狀態(tài)下，Dab2對于USP1-TSC1-PHLPP1復(fù)合物募集Akt以及抑制PI3K-Akt-FoxO信號至關(guān)重要。此外，USP1通過限制TSC1水平以維持mTOR介導(dǎo)的基礎(chǔ)蛋白合成速率，從而維持其自身的蛋白水平。作者認為，當(dāng)細胞能量水平較低時，Dab2可以招募Akt到USP1-TSC1-PHLPP1復(fù)合物中，從而有效終止生長信號的傳遞。

研究內(nèi)容

1.USP1是Akt的去泛素化酶? ? ?

????????作者通過免疫印跡法對喂食和禁食（2d）小鼠的骨骼肌提取物進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt在正常條件下處于泛素化狀態(tài)，但在禁食期間其泛素化水平降低，而未經(jīng)修飾的Akt累積。這表明，Akt在禁食期間被去泛素化。? ? ?

????????接著作者從正常肌肉勻漿中免疫沉淀Akt，并將沉淀加入含有活性DUB陣列的DUB篩選板。結(jié)果顯示，USP1/UAF1、USP11、OTUB2、OTUD5（p177S）和OTUD6A這五個DUBs切斷了Akt上的多泛素鏈并降低其泛素化水平。其中，USP1優(yōu)先去除K63連接的泛素鏈，這是Akt激活所必需的多泛素化類型。? ? ?

????????為探究USP1是否能在體內(nèi)將Akt去泛素化，作者分析了禁食期間USP1敲低對Akt泛素化的影響。結(jié)果顯示，USP1的下調(diào)抑制了Akt泛素化水平的降低，相反，Akt以泛素化形式累積。當(dāng)作者將USP1（C90S）質(zhì)粒導(dǎo)入細胞來抑制USP1功能時，也得到了類似的結(jié)果。進一步的研究表明，K63泛素化的Akt可能在禁食期間增加，而USP1催化該蛋白的去泛素化。? ? ?

????????為確定USP1是否切割A(yù)kt的K8-泛素鏈，作者將shLacz（對照）或HA-Akt（K8R）質(zhì)粒與USP1（C90S）共轉(zhuǎn)導(dǎo)入肌肉中以引起泛素化Akt的積聚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禁食2d時，HA-Akt（K8R）顯示出有限的泛素化，遠低于僅表達USP1（C90S）的內(nèi)源性Akt的泛素化水平。這些表明，在禁食期間抑制USP1會使得Akt在K8上發(fā)生泛素化。

研究結(jié)論：USP1在體內(nèi)對Akt的去泛素化至關(guān)重要，并且這很可能導(dǎo)致PI3K-Akt信號的抑制。

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2.USP1介導(dǎo)的去泛素化抑制了Akt在T308的磷酸化以及PI3K-Akt-Foxo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)??? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)，小鼠禁食2天后，胰島素受體、Akt及其靶點FoxO3和GSK3b的磷酸化水平顯著降低。然而，抑制USP1幾乎完全阻斷了這種現(xiàn)象。事實上，Akt（T308）、FoxO3和GSK3b的磷酸化水平在抑制USP1后與喂食小鼠相似。此外，盡管Akt的泛素化可以促進其在T308和S473的磷酸化，但在USP1被抑制而泛素化的Akt累積的肌肉中，Akt在S473的磷酸化水平仍然較低。

????????通常在禁食期間，F(xiàn)oxO被激活并刺激萎縮基因的表達，包括MuRF1和Atrogin 1。作者發(fā)現(xiàn)，通過shRNA（shUSP1）下調(diào)USP1會導(dǎo)致MuRF1和Atrogin1表達顯著降低。實驗表明，相對于喂食小鼠，禁食小鼠的平均重量減少了31%，但USP1的下調(diào)明顯減輕了這種消耗。另外，通過注射ML323特異性抑制USP1可顯著改善小鼠的糖耐量，并在禁食期間激活PI3K-Akt-FoxO信號通路。

研究結(jié)論：USP1的功能是使PI3K-Akt-FoxO信號在禁食期間減少的關(guān)鍵，而這導(dǎo)致葡萄糖攝取和蛋白質(zhì)合成降低、FoxO介導(dǎo)萎縮基因表達以及肌肉萎縮。

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3.Ser/Thr磷酸酶PHLPP1在禁食期間抑制Akt在S473的磷酸化

????????先前的研究表明，Ser/Thr蛋白磷酸酶PHLPP1能使Akt在S473發(fā)生去磷酸化。作者將特定的shRNA（shPHLPP1）導(dǎo)入小鼠TA肌肉來下調(diào)PHLPP1水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHLPP1的降低導(dǎo)致磷酸化的Akt（S473）和S6K（T389）增加，而磷酸化的Akt（T308）保持在較低水平。與Akt和S6K的磷酸化增加一致，PHLPP1下調(diào)也促進了蛋白質(zhì)合成。這種蛋白質(zhì)合成的增強可以解釋在表達shPHLPP1的纖維中觀察到的肌肉萎縮被顯著抑制的現(xiàn)象。作者還在喂食小鼠的肌肉中發(fā)現(xiàn)，PHLPP1和UAF1可與USP1共沉淀。

?研究結(jié)論：禁食期間，PHLPP1介導(dǎo)Akt在S473去磷酸化，其可能與USP1共同發(fā)揮作用，從而有效抑制Akt和PI3K-Akt-mTOR信號傳導(dǎo)。

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4.禁食時Akt被招募至USP1-PHLPP1復(fù)合物中??? ?

????????作者通過免疫沉淀和質(zhì)譜研究與Akt相互作用的組分，即PHLPP1、USP1及其輔助因子UAF1和FoxO3。質(zhì)譜分析顯示，只有29種蛋白是這四個組分的共同結(jié)合物，包括TSC1/TSC2復(fù)合物以及可抑制上皮細胞增殖的Dab2。? ?

????????喂食小鼠肌肉勻漿的甘油梯度分級表明，TSC1、TSC2、USP1/UAF1和PHLPP1沉淀到相同組分中，而Akt在這些組分中幾乎不存在。進一步研究表明，在禁食期間，Akt轉(zhuǎn)移到含有USP1/UAF1、TSC1/TSC2和PHLPP1的較重組分中，此時的Akt在T308的磷酸化水平降低。??

????????免疫沉淀實驗顯示，TSC2、USP1和PHLPP1可與TSC1共沉淀。研究表明，在禁食期間，USP1通過結(jié)合UAF1而被激活，并且招募Akt。然而，作者發(fā)現(xiàn)USP1與UAF1的結(jié)合并不是招募Akt所必需的，因為即使USP1/UAF1的結(jié)合受到干擾，Akt仍然可與USP1結(jié)合。

????????作者發(fā)現(xiàn)，在禁食期間，當(dāng)Akt被抑制時，USP1通過影響TSC1提高蛋白質(zhì)合成速率。TSC1在USP1被抑制時的積累并不是由于其基因表達增加，研究表明，USP1通過促進TSC1的降解來限制其含量。此外作者發(fā)現(xiàn)，在饑餓和非饑餓肌管中，USP1的下調(diào)均能導(dǎo)致泛素化TSC1的積累、Akt磷酸化水平升高以及S6K磷酸化水平降低。這表明正常情況下，USP1也調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號和TSC1的穩(wěn)定性。

研究結(jié)論：當(dāng)PI3K-Akt信號強度較低時，USP1通過限制TSC1以促進蛋白質(zhì)合成速率，并維持自身蛋白水平。USP1的下調(diào)會導(dǎo)致TSC1累積，并且USP1對TSC1的作用與其抑制Akt活性的作用無關(guān)。

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5.Dab2促進USP1-PHLPP1-TSC1復(fù)合物招募Akt
????????為探究Dab2是否影響禁食期間的PI3K-Akt信號活性，作者使用Dab2-DN載體作為Dab2-Akt結(jié)合的抑制劑。實驗結(jié)果顯示，在禁食期間，Akt與USP1、TSC1的結(jié)合增強。類似地，Dab2與該蛋白復(fù)合體的結(jié)合也在禁食時增加。研究發(fā)現(xiàn)，抑制Dab2-Akt的結(jié)合可以阻止Akt和Dab2被募集到USP1復(fù)合物中，這表明，Dab2在其中起作用并促進USP1招募Akt。

????????為了確定Dab2是否促進Akt去泛素化，作者在喂食和禁食小鼠的肌肉中免疫沉淀Akt，并通過SDS–PAGE和免疫印跡分析。結(jié)果顯示，在禁食狀態(tài)下，Akt的高分子量泛素化形態(tài)減少。而Dab2功能的抑制導(dǎo)致高分子量K63連接的泛素結(jié)合物在Akt上累積。因此，Akt的去泛素化依賴于Dab2的功能。

研究結(jié)論：Dab2對于禁食狀態(tài)下USP1誘導(dǎo)的Akt泛素化的減少以及由此產(chǎn)生的Akt和PI3K-Akt-FoxO信號的抑制至關(guān)重要。

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結(jié)論與討論

????????作者發(fā)現(xiàn)了一種抑制PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新機制，其中包括USP1對Akt的去泛素化。USP1通過與PHLPP1和TSC1結(jié)合實現(xiàn)對Akt的完全抑制。研究表明, Dab2可以將Akt募集到USP1-TSC1-PHLPP1復(fù)合物中，對調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號和維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義。因此, USP1可能是一個新的抑制肌肉萎縮和許多疾病的治療靶點，刺激USP1對Akt的作用以抑制PI3K-Akt-FoxO信號可能在癌癥治療中具有應(yīng)用潛力。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.201948791