生物標(biāo)志物是指能被客觀測量和評價，反應(yīng)生理或病理過程，以及對暴露或治療干預(yù)措施產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的指標(biāo)，對于疾病的鑒定、早期診斷及預(yù)防、治療過程中的監(jiān)控起到幫助作用。

體液樣本比較好取材，更適合biomarker研究。體液樣本中血液是最常應(yīng)用的，血液被認為與機體各器官聯(lián)系比較緊密，易于接收從各器官分泌的有變化的物質(zhì)，但其應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)并不是唯一選擇。

尿液以各種形式收集血液在穩(wěn)態(tài)機制下排出的廢物，匯集了大量的疾病相關(guān)變化，能夠更好地反映早期微小的變化，是biomarker研究的更好體液來源。接下來介紹兩篇應(yīng)用案例，揭示尿液在biomarker研究中的重要貢獻，并提供了典型biomarker研究策略。

案例一

2022年05月19日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室孫玉琳團隊，聯(lián)合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所孫偉團隊在國際知名期刊Nature Communications上聯(lián)合發(fā)表了題為“Noninvasive urinary protein signatures associated with colorectal cancer diagnosis and metastasis”的研究論文。該研究利用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在大規(guī)模隊列中發(fā)現(xiàn)了可用于診斷和轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測的標(biāo)志物組合，研究產(chǎn)生了高度準(zhǔn)確的無創(chuàng)尿蛋白特征，并將改善尿蛋白質(zhì)組學(xué)在未來結(jié)直腸癌（CRC）研究中的應(yīng)用。

研究背景

結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第二大原因。CRC的臨床診斷主要由區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LNM）和遠處轉(zhuǎn)移（DM）定義，LNM和DM也是與CRC患者生存和復(fù)發(fā)最直接相關(guān)的預(yù)后因素。目前臨床上基于影像學(xué)的單一監(jiān)測策略不足以評估轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，在臨床上仍然迫切需要更準(zhǔn)確和無創(chuàng)的生物標(biāo)志物。尿液是發(fā)現(xiàn)早期和敏感生物標(biāo)志物的來源，因為它可以迅速反映身體的變化。因此，尿液是生物標(biāo)志物分析的良好樣本。

樣本選擇

共選用552例尿液樣本；其中健康組（HC）289例，無轉(zhuǎn)移瘤（NM）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LNM）和遠處轉(zhuǎn)移（DM）的CRC患者共263例。

技術(shù)策略

TMT蛋白質(zhì)組學(xué)、PRM蛋白質(zhì)組學(xué)、定量點印跡分析、IHC分析

研究思路

研究結(jié)果

基于TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)在四組中分別鑒定出2291，2642，3363和3181蛋白質(zhì)。對4組995種常見蛋白進行無監(jiān)督主成分分析（PCA），觀察HC與CRC不同分期患者之間的尿蛋白譜差異。結(jié)果表明HC和CRC組之間存在明顯差異（圖2a)。NM、LNM或DM和HC之間的成對差異尿蛋白采用平均倍數(shù)變化≥1.5的標(biāo)準(zhǔn)進行定義，分別鑒定出273、337和355個差異蛋白。IPA分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白在腫瘤相關(guān)通路中顯著富集，包括腫瘤生長、腫瘤侵襲、免疫反應(yīng)、代謝和信號傳導(dǎo)（RAC、FAK、CDC42和RhoA)途徑（圖2b-f）。

隨后研究人員采用靶向高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)PRM來驗證差異尿蛋白。在發(fā)現(xiàn)階段鑒定的CRC相關(guān)和CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)差異蛋白中，分別選擇了112和54種差異蛋白進行PRM驗證。其中41種差異蛋白其趨勢與TMT方法一致，包括18種下調(diào)和23種上調(diào)蛋白。接下來選擇14種相互依賴性較低的蛋白進行隨機森林分析確定診斷模型和轉(zhuǎn)移模型中最重要的特征（圖3b）。同時使用ROC分析檢測每種蛋白質(zhì)在診斷和轉(zhuǎn)移風(fēng)險分層中的分類性能（圖3c)。最終建立了用于CRC診斷的尿蛋白標(biāo)志物組合（CORO1C，ARPC5和RAD23B），以及用于CRC轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測的標(biāo)志物組合（CORO1C，RAD23B，GSPT2和NDN）。

?

為了驗證尿液特征以大規(guī)模區(qū)分HC和CRC患者，研究人員開發(fā)了一種基于尿液的定量點印跡檢測系統(tǒng)。通過每種蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線量化尿蛋白量，然后通過相應(yīng)的尿肌酐測量值進行校準(zhǔn)。進一步在434份尿液樣本中進行免疫學(xué)驗證，發(fā)現(xiàn)CRC患者尿液中CORO1C，ARPC5，RAD23B，GSPT2和NDN的濃度顯著高于HC的尿液（P?<0.0001）。在三個CRC組中，這五種尿液蛋白的水平顯示出與疾病進展相關(guān)的梯度增加的趨勢，且在DM達到最高水平（P<0.01）。

?圖3.?使用點印跡分析獨立驗證尿液蛋白特征

為了評估尿液中三種診斷相關(guān)蛋白（CORO1C、RAD23B和ARPC5）的異常改變是否來自CRC腫瘤組織，研究人員在幾個組織微陣列中進行了免疫組織化學(xué)染色測定。CORO1C和ARPC5定位于細胞質(zhì)中，而RAD23B主要定位于細胞質(zhì)和細胞核中。CRC腫瘤組織的CORO1C、RAD23B和ARPC5免疫染色陽性，與鄰近的非癌組織（所有P<0.0001）相比，表現(xiàn)出顯著上調(diào)。Kaplan–Meier生存分析表明，CORO1C和RAD23B在診斷和轉(zhuǎn)移特征上是共同的，高水平的CORO1C和RAD23B組織表達促進大腸癌中惡性細胞的轉(zhuǎn)移潛能，且與不良預(yù)后顯著相關(guān)。然而ARPC5在大腸癌中沒有預(yù)后意義。

小結(jié)

該研究利用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)方法，并結(jié)合discovery-verifification-validation的標(biāo)志物研究策略，系統(tǒng)地分析了用于CRC診斷和預(yù)后的尿蛋白。該研究是目前為止在CRC中規(guī)模最大、最全面的尿液生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究。尿液蛋白質(zhì)組可以全面反映不同CRC階段的病理生理變化，即使在CRC早期也是如此。該研究結(jié)果提供了有希望的尿蛋白生物標(biāo)志物，可以可靠地診斷和檢測CRC，同時也表明了轉(zhuǎn)移性CRC的潛在介入靶點。由于只有少數(shù)早期CRC患者入組，因此需要進一步驗證檢測一級CRC的診斷模型的準(zhǔn)確性。還需要使用更大的隊列進行外部驗證，以概括結(jié)論。

案例二

2022年6月22日，北京師范大學(xué)高友鶴教授團隊在蛋白質(zhì)組學(xué)期刊Clin Proteomics上在線發(fā)表了題為“Many kinds of oxidized proteins are present more in the urine of the elderly”的研究論文。該研究利用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次表明了氧化蛋白存在于尿液中，并且老年人的氧化率高于年輕人。揭示了提高氧化蛋白在體內(nèi)通過腎臟的排泄程度可能有助于維持身體內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，延緩衰老和老年性疾病的發(fā)生。

研究背景

近一個世紀(jì)以來，科學(xué)家們一直在不斷探索衰老的奧秘，并試圖找到減緩衰老的方法。一些研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激會加劇衰老和與年齡相關(guān)的疾病。因此，防止氧化應(yīng)激是介導(dǎo)長壽動物模型中觀察表型的常見手段。而尿液為許多疾病提供了另一種有前途的臨床可行基質(zhì)，因為它可以頻繁且無創(chuàng)地大量收集，特別是提供診斷和預(yù)后機會。然而，只有少數(shù)PTM被應(yīng)用于尿液生物標(biāo)志物研究。該研究首次探索了尿蛋白修飾與衰老之間的關(guān)系。

樣本選擇

共收集38名健康個體的尿液樣本；其中包括兒童22例和老年人6例（RAW數(shù)據(jù)從已發(fā)表的研究下載），以及年輕組10例

技術(shù)策略

LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)（搜索不同修飾）

研究思路

研究結(jié)果

基于非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在38個樣本中共鑒定出1480個修飾，這些修飾發(fā)生在蛋白質(zhì)鏈中的20個氨基酸以及N和C末端。量化的修飾強度跨越了七個數(shù)量級，其中前十個最豐富的蛋白質(zhì)貢獻了整個修飾強度的81-91%（圖1c）。圖1d顯示了3個不同年齡的已識別修飾數(shù)，并且兒童、年輕和老年階段有變化的修飾之間的重疊是顯著的（圖1e，pvalue<0.05，F(xiàn)C>2或<0.5）。主成分分析顯示出不同年齡組的有效分離（圖1f-g）。此外根據(jù)每個年齡組每種修飾的比值（修飾位點數(shù)/肽段數(shù)）計算了不同氨基酸修飾的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在脯氨酸（Pro，P）、色氨酸（Trp，W）、酪氨酸（Tyr，Y）、半胱氨酸（Cys，C）、亮氨酸（Leu，L）、苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)）、纈氨酸（Val，V）和異亮氨酸（Ile，I）的非人工修飾中，氧化和氨基酸取代占主導(dǎo)地位，特別是在脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸中，老年組的氧化速率高于其他年齡組（圖1h）。

為了最大限度地減少Open-search帶來的假陽性結(jié)果，對于所獲得的顯著表達的氧化修飾和AA取代，通過重復(fù)搜索識別進一步檢查這些修飾的真實性。通過超級計算發(fā)現(xiàn)11種氧化修飾和3種AA取代的表達隨年齡增長而顯著增加（圖2g）采用Wilcoxon秩和檢驗建立單個標(biāo)志物的統(tǒng)計顯著性，并評價整個ROC曲線的顯著性。其中，4個氧化和1個AA取代的AUC>0.99（圖2j）。

為了驗證不同年齡組的氧化修飾，作者接下來收集了來自21-72歲個體的28個樣本，以重復(fù)上述實驗過程。在年輕、中年和老年組中存在7種差異表達的氧化，它們是潛在的衰老診斷標(biāo)志物（圖3d）。7種差異表達的氧化所屬的蛋白中，骨橋蛋白（基因SPP1）的氧化位點在所有氧化蛋白中最高。此外，作者還在喂養(yǎng)了27天、240天和600天7只雄性大鼠的尿液樣本中進一步驗證該結(jié)果。所有氧化修飾的無監(jiān)督聚類分析顯示，老年大鼠可以和年輕和成年階段顯著區(qū)分開來。與其他組相比，老年大鼠的8種氧化差異，隨著年齡的增長幾乎呈線性增加（圖3e）。

為了評估尿液中三種診斷相關(guān)蛋白（CORO1C、RAD23B和ARPC5）的異常改變是否來自CRC腫瘤組織，研究人員在幾個組織微陣列中進行了免疫組織化學(xué)染色測定。CORO1C和ARPC5定位于細胞質(zhì)中，而RAD23B主要定位于細胞質(zhì)和細胞核中。CRC腫瘤組織的CORO1C、RAD23B和ARPC5免疫染色陽性，與鄰近的非癌組織（所有P<0.0001）相比，表現(xiàn)出顯著上調(diào)。Kaplan–Meier生存分析表明，CORO1C和RAD23B在診斷和轉(zhuǎn)移特征上是共同的，高水平的CORO1C和RAD23B組織表達促進大腸癌中惡性細胞的轉(zhuǎn)移潛能，且與不良預(yù)后顯著相關(guān)。然而ARPC5在大腸癌中沒有預(yù)后意義。

小結(jié)

該研究發(fā)現(xiàn)一些修飾在老年人中高于年輕人，其中氧化占很大比例。這些修飾的蛋白質(zhì)可能由于結(jié)構(gòu)變化而從體內(nèi)排出，導(dǎo)致功能喪失甚至對身體有害的影響。代謝或減少這些蛋白質(zhì)的積累對于維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)甚至延緩衰老和衰老相關(guān)疾病可能具有重要意義。