前言

2022年9月15日，一篇題為“Single-cell RNA sequencing combined with whole exome sequencing reveals the landscape of the immune pathogenic response to chronic mucocutaneous candidiasis with STAT1 GOF mutation”關(guān)于對CMC患者PBMC樣本的單細(xì)胞以及全外顯子測序的文章，發(fā)表于《Frontiers in Immunology》（IF：8.786）期刊。作者發(fā)現(xiàn)了該名CMC患者具有STAT1 GOF (c.Y289C) 突變以及免疫細(xì)胞群的改變，確立了單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)作為研究CMC免疫致病反應(yīng)策略的可行性，有助于對該突變引起的CMC的臨床特征有更深入的了解。

基本信息

期刊：Frontiers in Immunology

影響因子：8.786

材料：健康人和CMC患者的PBMC樣本

方法：10×Genomics scRNA-seq、Whole exome sequencing

研究結(jié)果

Result 1 患者的臨床信息

患者為臨床診斷為慢性皮膚粘膜念珠菌?。–MC）的12歲男孩(圖1A，B，C，D)，由于患者的父母都正常，且在家族史中沒有類似的病例，因此推測患者是新生突變或者隱性純和，于是采取了患者及其父母的外周血進(jìn)行了全外顯子測序（WES）。WES結(jié)果表明患者體內(nèi)的STAT1基因發(fā)生雜合突變，導(dǎo)致酪氨酸被半胱氨酸取代(c.866 A>G；p.Y289C)，而他的父母都沒有攜帶該突變(圖1E)。通過Sanger測序驗證了WES測序數(shù)據(jù)，并確定了該突變的位置(圖1F)。

圖1 | 一例CMC患者的臨床特征、實驗室檢查和基因檢測

Result 2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)揭示了CMC免疫細(xì)胞群的改變

在患者以及健康對照的PBMC樣本中，分別捕獲了11430和10191個單細(xì)胞，經(jīng)過Seurat質(zhì)控后，分別從患者和健康對照中獲得了7393個和9186個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步降維聚類后將所有細(xì)胞分成了10個cluster(圖2)，根據(jù)已知標(biāo)記基因的表達(dá)，確定了單核細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞譜系(圖3A-D)。與健康對照組相比，患者外周血單核細(xì)胞減少，NK細(xì)胞增加。然后作者對T細(xì)胞和B細(xì)胞做進(jìn)一步的亞群分析 (圖3E，F(xiàn))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照者相比，該患者的PBMC樣本中Naive B占比較多，而immature B相對較少。

圖2 | 單細(xì)胞RNA-seq研究設(shè)計和降維聚類結(jié)果圖

圖3 | 細(xì)胞類型鑒定

為了進(jìn)一步探索患者和健康對照組PBMC中差異表達(dá)基因，作者做了差異以及富集分析(圖4B-E)。富集分析表明，患者下調(diào)的差異基因多富集到多肽抗原與MHC-II類蛋白復(fù)合體的組裝，中性粒細(xì)胞的脫顆粒，免疫反應(yīng)，溶酶體等條目；而上調(diào)的差異基因在細(xì)胞質(zhì)翻譯，多聚核糖體，核糖體的結(jié)構(gòu)組成等條目中富集。接下來，作者進(jìn)一步比較CMC患者和健康對照組的差異基因來發(fā)現(xiàn)與CMC相關(guān)的免疫分子特征(圖4A和圖5)。與對照組相比，患者外周血中RGS1以及TNFAIP3的表達(dá)明顯上調(diào)。RGS1在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞的定位方面發(fā)揮重要作用，也可以通過趨化因子信號調(diào)節(jié)B細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)。TNFAIP3不僅通過NF-kB途徑抑制炎癥，而且還抑制STAT1和IFN-γ途徑。

此外，TNFAIP3對Th17細(xì)胞分泌IL-17起負(fù)調(diào)節(jié)作用，CMC通常表現(xiàn)為嚴(yán)重的T細(xì)胞免疫缺陷，主要與Th17細(xì)胞通路受損有關(guān)，因此TNFAIP3可能是CMC的一個潛在致病機(jī)制。與健康對照組相比，CMC患者CTSS的表達(dá)顯著下調(diào)。CTSS主要表達(dá)在B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞中，并調(diào)節(jié)抗原的處理和提呈以及T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，CTSS表達(dá)降低會影響蛋白水解酶活性及相關(guān)的酶免疫反應(yīng)。

圖4 | 差異表達(dá)基因的篩選和功能分析

圖5 | 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

文章總結(jié)

本文作者在一名CMC患者中發(fā)現(xiàn)了外周血單核細(xì)胞和immature B細(xì)胞減少以及STAT1 GOF突變 (c.Y289C)的現(xiàn)象，進(jìn)一步分析揭示了患者和健康對照組之間與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的差異表達(dá)基因。在這項研究中，作者采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，比常規(guī)臨床試驗更深入地了解CMC的病理機(jī)制，通過分析PBMCs的DEGs來探索潛在的相關(guān)基因，并更全面地闡述了具有STAT1 GOF突變的CMC患者的免疫反應(yīng)。單細(xì)胞分析結(jié)果反映了患者在抗原提呈和抗菌作用方面的免疫缺陷。本研究的局限性在于CMC病例數(shù)量較少，未來需要加大樣本量的研究來揭示患者之間的差異，此外，后續(xù)還可以通過細(xì)胞或動物實驗對單細(xì)胞測序的結(jié)果進(jìn)行驗證。

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（單細(xì)胞測序、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、全外顯子測序）

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