隨著現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，蛋白質(zhì)藥物變得備受關(guān)注，而蛋白質(zhì)藥物的N端序列分析對(duì)于醫(yī)藥工業(yè)來(lái)說(shuō)是非常重要的信息。N-端序列與蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性息息相關(guān)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行N-端測(cè)序分析，可以確定蛋白質(zhì)的起點(diǎn)，有利于幫助分析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

百泰派克生物科技BTP為您提供多種蛋白質(zhì)N端序列分析技術(shù)服務(wù)，基于Edman降解法的蛋白質(zhì)N端序列檢測(cè)、基于高分辨質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)N端序列檢測(cè)，詳見(jiàn)如下介紹：

一、基于Edman降解法的蛋白質(zhì)N端序列分析

1. 原理:

Edman測(cè)序反應(yīng)是一個(gè)循環(huán)過(guò)程，即在弱堿性條件下使多肽/蛋白與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)，然后用酸處理，從多肽鏈上僅使氨基末端殘基以氨基酸的苯基乙內(nèi)酰硫脲衍生物的形態(tài)游離出來(lái)，然后對(duì)分離出的氨基酸進(jìn)行鑒定。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器：

全自動(dòng)蛋白質(zhì)/多肽測(cè)序儀（PPSQ33A）

3. 應(yīng)用：

Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)N端序列，通過(guò)跑膠轉(zhuǎn)?；蛘唿c(diǎn)膜的方式進(jìn)行樣品處理，可以直接分析氨基酸信息，不需要任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)就可以準(zhǔn)確分析N端氨基酸序列，特別是能辨別異亮氨酸和亮氨酸、谷氨酰胺和賴(lài)氨酸。但是Edman降解法的通量低，而且不適用于N端已被化學(xué)修飾或封閉的蛋白或者多肽不可用。

4. 結(jié)果展示：

為對(duì)19種PTH-氨基酸進(jìn)行校準(zhǔn)，故先測(cè)試19種PTH氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品，校準(zhǔn)測(cè)試混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜如下：

標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測(cè)試圖譜

PTH氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測(cè)試完成后，測(cè)試樣品的N-端序列，樣品測(cè)試圖譜如下：

N端第1位

N端第2位

N端第3位

通過(guò)上述圖譜可以確定蛋白質(zhì)N端序列為T(mén)yr-Val-Trp。

二、基于高分辨質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)N端序列檢測(cè)

1. 原理:

20世紀(jì)80年代末發(fā)展的電噴霧電離（ESI）使質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析上的應(yīng)用發(fā)生了革命性飛躍。對(duì)于基于高分辨質(zhì)譜法的N端測(cè)序，樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白后使用蛋白酶酶解，酶解后產(chǎn)的產(chǎn)物用Q-Exactive系列質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行質(zhì)譜分析，肽段在質(zhì)譜中碎裂得到b、y離子的二級(jí)質(zhì)譜圖，通過(guò)圖譜與蛋白理論氨基酸序列比對(duì)確定蛋白質(zhì)的N端位置。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器：

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：高效液相色譜儀-Easy-nLC 1200；電噴霧-組合型離子阱Orbitrap 質(zhì)譜儀-Q Exactive? Hybrid Quadrupole-Orbitrap? Mass Spectrometer。

3. 應(yīng)用：

基于高分辨質(zhì)譜法的N端測(cè)序，可以通過(guò)高分辨率質(zhì)譜分析N端封閉和翻譯后修飾(PTMs)，從而確定蛋白質(zhì)N端起點(diǎn)。對(duì)于復(fù)雜的蛋白，我司支持對(duì)復(fù)雜蛋白進(jìn)行N端二甲基化標(biāo)記，通過(guò)分析標(biāo)記位置確定復(fù)雜蛋白樣品中的多個(gè)蛋白的N端起點(diǎn)。

4. 結(jié)果展示：

蛋白藥物樣品的N端氨基酸序列分析：

Trypsin酶解后的樣品經(jīng)過(guò)LC-MS/MS分析后得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)與理論數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，得到和理論N端序列（HYAHVDCPGHADYVK）相符合的MS2圖譜，圖譜如下：

N端序列二級(jí)質(zhì)譜圖

通過(guò)以上分析可以得出此蛋白藥物的N端起始氨基酸為組氨酸，N端序列為HYAHVDCPGHADYVK。

常見(jiàn)問(wèn)題：

問(wèn)題1：Edman降解法和質(zhì)譜法檢測(cè)蛋白質(zhì)N端的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)？

回答：

質(zhì)譜法：?

優(yōu)點(diǎn)：

1.能獲取更長(zhǎng)的N端序列信息；

2.可分析N端封閉和PTMs。

缺點(diǎn)：

1.等重的氨基酸不能確定；

2.肽序列的覆蓋率很少是100%。

Edman降解法：

優(yōu)點(diǎn)：

1.可以準(zhǔn)確分析N端氨基酸序列，特別是能辨別異亮氨酸和氨酸、谷氨酰胺和賴(lài)氨酸；

2.直接分析氨基酸信息，不需要任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，可以識(shí)別未登記在數(shù)據(jù)庫(kù)中的未知蛋白質(zhì)。

缺點(diǎn)：

1. N端已被化學(xué)修飾或封閉的肽不可用；

2. 低通量分析。

問(wèn)題2：N端發(fā)生修飾的蛋白如何確定其N(xiāo)端位置？

回答：

在數(shù)據(jù)分析時(shí)同時(shí)分析N端的PTMs，分析鑒定出有修飾的N端位置。