非酒精性脂肪肝（NAFLD）以肝臟內(nèi)甘油三酯的過度積聚為特征，與代謝紊亂密切相關。肝臟負責豐富的蛋白質(zhì)合成和代謝穩(wěn)態(tài)的協(xié)調(diào)。在疾病條件下，超負荷的蛋白質(zhì)合成超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的儲存能力，損害其在肝細胞中的功能完整性，這可能會促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。此外，受損的胰島素信號傳導導致葡萄糖/脂質(zhì)儲存和處置的失衡，引發(fā)一系列細胞內(nèi)應激信號以響應代謝紊亂，在NAFLD的病理生理學中發(fā)揮重要作用。然而，在各種研究中，NAFLD中肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是增強還是抑制仍存在爭議。此外，關于ER應激反應受損如何影響代謝以及哪些ER應激反應分子參與了這一過程，目前還知之甚少。中山大學附屬第三醫(yī)院陳燕銘/石國軍教授團隊在PHARMACOL RES發(fā)表題為Secreted MUP1 that reduced under ER stress attenuates ER stress induced insulin resistance through suppressing protein synthesis in hepatocytes的研究論文，該研究利用轉錄組和蛋白組數(shù)據(jù)分析揭示了MUP1減輕肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關鍵作用，重組MUP1或其潛在衍生物可能是緩解NAFLD的一個有效的治療靶點。其中，中科新生命提供了轉錄組和蛋白組的檢測和技術支持服務。

研究材料

小鼠肝臟組織、血清、尿液、小鼠原代肝細胞、AML12細胞、HepG2細胞

?技術路線

步驟1：在NAFLD小鼠模型中，肝組織中MUP蛋白顯著減少；

步驟2：在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下，肝細胞中MUP1蛋白表達和分泌減少；

步驟3：MUP1刺激肝細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣流出并誘導急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應；

步驟4：MUP1干預能夠引起肝細胞預適應于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，進而緩解藥物引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的胰島素抵抗。

?研究結果

1.??NAFLD小鼠肝臟中MUP蛋白減少

生理指標檢測結果發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠表現(xiàn)出體重過度增加、肝臟與體重和脂肪與體重的比率增加，以及肝臟甘油三酯含量顯著增加。為了進一步探討NAFLD小鼠肝臟內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，作者采用了蛋白質(zhì)組學分析，結果顯示NAFLD小鼠的多種MUP亞型的顯著下降，其中MUP1亞型可能對代謝貢獻最大。這些數(shù)據(jù)表明MUPs，尤其是MUP1，可能是參與NAFLD代謝調(diào)節(jié)的重要因子。

2. NAFLD小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應受損

KEGG分析顯示，“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工”途徑顯著豐富。NAFLD小鼠中，未折疊蛋白應答（UPR）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白降解（ERAD）途徑的表達模式發(fā)生了明顯改變。且WB結果顯示，在NAFLD小鼠的肝臟中，IRE1α和PERK的水平顯著增加，而p-eIF2α、ATF4和BiP的水平顯著降低，這表明在代謝紊亂和肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中UPR信號失調(diào)導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔增加。這些數(shù)據(jù)表明，在NAFLD小鼠模型中，肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應受損?。??

3. ?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下肝細胞MUP1的表達降低

接下來，作者將NAFLD小鼠和對照小鼠腹腔注射衣霉素（Tm，一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑）或等量DMSO以建立肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激小鼠模型，蛋白質(zhì)檢測結果顯示MUPs的水平在肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型中顯著降低。WB分析證實了MUP1在肝臟中的類似表達模式。因此，MUPs被鑒定為代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應蛋白，這表明MUPs可能是NAFLD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和代謝的潛在聯(lián)系。

4. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中MUP1聚集

為了解決MUP1響應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激而降低的機制，對肝臟切片進行免疫熒光染色以確定MUP1在肝臟中的分布。共聚焦顯微鏡分析顯示，與對照小鼠相比，MUP1保留在Tm小鼠的肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。進一步表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下MUP1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的滯留增加，這部分解釋了細胞中成熟MUP1的減少。

5. MUP1刺激肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子外流并誘導急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

用MUP1處理原代肝細胞并進行RNA測序，GSEA分析顯示，“鈣信號通路”顯著富集（圖5B）。由于鈣穩(wěn)態(tài)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和細胞命運至關重要，因此，作者推測MUP1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應蛋白，可能通過反饋參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的調(diào)節(jié)。為了進一步研究MUP1對肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，用毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）作為調(diào)節(jié)Ca2+濃度的陽性對照。結果顯示，MUP1處理瞬時刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑。值得注意的是，MUP1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響與Tg相似，表明MUP1對Ca2+穩(wěn)態(tài)的潛在作用。而在無Ca2+溶劑中用MUP1處理，Ca2+從ER流出，顯著增加了胞漿Ca2+濃度。這些數(shù)據(jù)表明，MUP1刺激肝細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流并誘導急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。

6. MUP1預處理抑制蛋白質(zhì)合成并減輕肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和胰島素抵抗

為了進一步研究MUP1在短暫刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的生理意義，將原代肝細胞用MUP1預處理后用Tm處理誘導應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。WB和轉錄組結果表明，Tm顯著增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物的蛋白質(zhì)水平，包括GADD34、ATF4、CHOP、XBP1s和p-eIF2α，而MUP1預處理可抑制ER應激。接下來，作者評估了抑制肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對胰島素反應的影響。MUP1預處理細胞受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，Akt顯著增強，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記物顯著減弱，這表明胰島素敏感性和肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激得到改善。該數(shù)據(jù)表明，MUP1預處理在體外減輕了肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的胰島素抵抗。

7. MUP1預處理減輕Tm誘導的肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

為了評估MUP1在體內(nèi)的病理生理作用，用MUP1預處理小鼠然后腹腔注射Tm以建立急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型，Tm處理導致明顯的肝臟甘油三酯積聚和空泡化，MUP1預處理組有所改善，結果表明MUP1預處理減輕了Tm誘導的過度肝臟脂肪變性。同時，作者還研究了腎臟中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。有趣的是，MUP1預處理顯著減輕了Tm誘導的腎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，這表明MUP1對體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的影響?。

?小編小結

在這項研究中，作者提供了肝臟MUPs顯著降低導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激受損的證據(jù)。MUP1作為MUP家族中最豐富的成員，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成和加工，它受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的負調(diào)節(jié)。從機制上講，肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致MUP1形成聚集體并被困在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而減少MUP1的分泌。此外，在肝細胞中補充重組MUP1增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流至胞漿中，并短暫誘導預適應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，這有助于肝細胞通過抑制蛋白質(zhì)合成來減輕化學誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的胰島素抵抗，表明NAFLD的潛在治療靶點。