T細(xì)胞(T?cell、T淋巴細(xì)胞/T?lymphocyte)是淋巴細(xì)胞的一種，在免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)分化成熟，成熟后移居于周圍淋巴組織中。隨著細(xì)胞免疫治療的日益深入，T細(xì)胞的基因工程化改造顯得越來越重要。

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然而，T細(xì)胞的基因操作卻異常困難，普通的DNA質(zhì)粒根本就轉(zhuǎn)不進(jìn)去，即使是病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染操作，也有不少難題，主要體現(xiàn)在幾個方面:

1?常規(guī)的慢病毒，由于

• ?T細(xì)胞膜上受體的不穩(wěn)定；

• ?非激活的T細(xì)胞本身無增殖能力；

• ?T細(xì)胞內(nèi)部有阻礙反轉(zhuǎn)錄的機(jī)制等原因而導(dǎo)致慢病毒的T細(xì)胞感染能力 偏弱，需要多次重復(fù)感染，且對于實(shí)驗(yàn)操作的條件要求十分苛刻

2體外培養(yǎng)的T細(xì)胞本身十分敏感且脆弱，慢病毒感染對細(xì)胞的狀態(tài)影響非常大

3T細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，進(jìn)一步增大了病毒感染的難度

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遇上這樣“磨人的細(xì)胞”怎么辦？

漢恒病毒載體工程師們深切體會到了大家的痛苦?

通過多次實(shí)驗(yàn)，研發(fā)出適用于原代T細(xì)胞基因操作的懸浮細(xì)胞專用的腺病毒（Ads）和慢病毒（hTLv）。其中Ads也非常適用感染其他懸浮細(xì)胞，如Jurkat，K562，HL-60和L1210等。慢病毒hTLv適用人原代T細(xì)胞的感染還可以用來構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)系。

感染效果圖

漢恒原代T細(xì)胞感染實(shí)例——使用懸浮細(xì)胞專用腺病毒ads感染

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懸浮細(xì)胞專用腺病毒Ads感染小鼠原代CD4+ T細(xì)胞

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細(xì)胞：小鼠原代CD4+ T細(xì)胞

刺激方式：CD3/CD28抗體和IL-2激活48h

病毒：Ads-GFP, 1×10^10 PFU/ml

使用方式：MOI=500

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懸浮細(xì)胞專用腺病毒Ads感染人原代CD4+ T細(xì)胞

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細(xì)胞：人原代CD4+ T細(xì)胞

刺激方式：CD3/CD28抗體和IL-2激活48h

病毒：Ads-GFP， 1×10^10 PFU/ml

使用方式：MOI=100

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漢恒原代T細(xì)胞感染實(shí)例——使用慢病毒

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原代T細(xì)胞專用病毒-慢病毒感染人原代CD4+ T細(xì)胞

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細(xì)胞：人原代CD4+ T細(xì)胞

刺激方式：CD3/CD28抗體和IL-2激活48h

病毒：hTLv-GFP，1*10^8 TU/ml

使用方式：MOI=50

上文我們了解到T細(xì)胞是很難被感染的，除了使用正確的病毒工具外，在細(xì)胞制備后想要成功感染T細(xì)胞還有兩個關(guān)鍵步驟：細(xì)胞體外刺激、細(xì)胞感染?

細(xì)胞體外刺激

1.?按照小鼠或人源?CD4+T?細(xì)胞分離?kit (Thermo)?說明書分離得到?CD4+T?細(xì)胞。

2.?取所需體積的?PBS，按照?5?μg/ml?的終濃度加入?Anti-mouse CD3e?和?Anti-mouse CD28?抗體，500 μl/孔包被?Non-Treated 24-well plate，室溫放置?4 h，吸掉抗體懸液，加入?500 μl 1% BSA（PBS?配置）室溫封閉?30 min，封閉結(jié)束加入?500 μl PBS?洗孔一次。

注：請在分離細(xì)胞的同時準(zhǔn)備好平板，包括后續(xù)感染所需的量。

3．將分離得到的?CD4+?T?按照濃度?5x105 cell/ml?重懸在完全?T?細(xì)胞培養(yǎng)基中（1640，10% FBS，1% penicillin-streptomycin，?50?μM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2），將細(xì)胞加入步驟?2?中包被處理好的平板，2 ml?每孔（1x106 cell/well），然后放入?37℃?CO2培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)?48 h。細(xì)胞在刺激?24 h?后體積略微增大，進(jìn)入活化狀態(tài)，刺激?48 h?后可進(jìn)行病毒感染。

細(xì)胞感染

1.?收集活化好的?CD4+T?細(xì)胞，400 g?離心?5 min。用?T?細(xì)胞培養(yǎng)基重懸計數(shù)備用，在收集的過程中發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞會貼壁，此為正常現(xiàn)象，可反復(fù)吹打至貼壁的細(xì)胞也呈懸浮狀態(tài)。

2.?另取一?Anti-mouse CD3e?和?Anti-mouse CD28?抗體包被好的?24?孔板，每孔加入?2-5x105?的細(xì)胞（若為?96?孔板，加入?2x104?細(xì)胞/孔）。若考慮長期表達(dá)目的基因，按?MOI=50-100?加入漢恒生物?T?細(xì)胞專用慢病毒?hTLv-GFP，注意鼠源和人源原代?T?細(xì)胞所適合的慢病毒種類差別；若考慮瞬時（一周以內(nèi)）表達(dá)目的基因，可按?MOI=500-1000?加入漢恒懸浮細(xì)胞專用腺病毒?Ads-GFP。同時加入?polybrene?至終濃度?6 g/ml，最終感染體積為?500 μl，加入病毒后輕輕吹打混勻。

注：具體 MOI 選擇可在 96 孔板中預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行梯度摸索，對于慢病毒建議使用 10，30，100 的梯度進(jìn)行，對于腺病毒建議使用 500，1000，1500 的梯度進(jìn)行摸索。

3.?24-wellplate?于?1000 g?室溫離心感染?90 min。離心結(jié)束后將平板放入?37℃?CO2?培養(yǎng)箱感染?6 h。

注：離心結(jié)束觀察細(xì)胞分散狀態(tài)，除非細(xì)胞全聚集在一處，否則不建議吹散細(xì)胞。

4.?感染結(jié)束后取出培養(yǎng)板，小心吸掉感染孔中?350 μl?的培養(yǎng)基（70%），加入?1.85 ml?的?T?細(xì)胞完全培養(yǎng)基補(bǔ)足體積為?2 ml?并吹打混勻。

5.?可選步驟：病毒感染?24 h?后，小心吸掉培養(yǎng)基，在同一培養(yǎng)皿中按照?2-4?步進(jìn)行病毒復(fù)感染操作。

6.?將細(xì)胞放入?37℃?CO2?培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2～3?天后可觀察熒光，做流式檢測感染效率。正常情況下，漢恒生物提供的?T?細(xì)胞專用慢病毒（hTLv）和懸浮細(xì)胞專用腺病毒（Ads）感染原代?T?細(xì)胞的效率大于?50%。