名詞解釋：

基因是核酸中貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列。

基因組（gencme）：細胞或生物中，一套完整單倍體遺傳物質(zhì)的總和（包括一種生物所需的全套基因及間隔序列）稱為基因組。基因組的功能是貯存和表達遺傳信息。

SD序列(Shine-Dalgarno sequence,SD sequence) 是mRNA能在細菌核糖體上產(chǎn)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯所需要的序列。SD序列與16S rRNA的3’末端堿基(AUUCCUCCAC-UAG-5’)互補，以控制轉(zhuǎn)譯的起始

分子克?。嚎寺。╟lone）：是指單細胞純系無性繁殖，現(xiàn)代概念是將實驗得到的人們所需的微量基因結(jié)構(gòu)，引入適當?shù)乃拗骷毎腥ィ诤线m的生理環(huán)境中進行無性繁殖，從而利用宿主的生理機制繁衍人們所需要的基因結(jié)構(gòu)，并進行表達。由于整個操作在分子水平上進行，所以稱為分子克?。╩olecular cloning）。

動物克隆(Animal cloning)就是不經(jīng)過受精過程而獲得動物新個體的方法.

基因診斷：就是利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)

（DNA水平）及其表達水平（RNA水平）是否正常，從而對疾病做出診斷的方法。

基因治療就是將有功能的基因轉(zhuǎn)移到病人的細胞中以糾正或置換致病基因的一種治療方法，是指有功能的目的基因?qū)氚屑毎笥械目膳c宿主細胞內(nèi)的基因發(fā)生整合，成為宿主細胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因的表達產(chǎn)物起到對疾病的治療作用。

轉(zhuǎn)基因動物就是把外源性目的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蚱淠遗呒毎?，并在細胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動物（foster mother）的子宮內(nèi)，使之發(fā)育成具有表達目的基因的胚胎動物，并能傳給下一代。這樣，生育的動物為轉(zhuǎn)基因動物。

探針：在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進行標

記。這種帶有一定標記的已知順序的核酸片段稱為探針。

限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）是一類專門切割DNA的酶，它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識別順序的特殊DNA序列并切割dsDNA。

載體：要把一個有用的基因（目的基因-研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

限制性片段長度多肽性分析(RFLP):DNA片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymer-phism,RFLP）基因突變導致的基因堿基組成或(和)順序發(fā)生改變,會在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點或使原有的位點消失. 用限制酶對不同個體基因組進行消化時，其電泳條帶的數(shù)目和大小就會產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在。

簡答題：

1.蛋白質(zhì)的生物合成過程中的成分參與，參與因子，作用？

mRNA是合成蛋白質(zhì)的“藍圖（或模板）” ?????tRNA是原料氨基酸的“搬運工”

rRNA與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體作為合成多肽鏈的裝配機（操作臺）

tRNA

mRNA是合成蛋白質(zhì)的藍圖，核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠，但是，合成蛋白質(zhì)的原料——20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，需要轉(zhuǎn)運RNA把氨基酸搬運到核糖體中的mRNA上

rRNA

核糖體RNA（rRNA）和蛋白質(zhì)共同組成的復合體就是核糖體，核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所。

核糖體的大小亞基在行使翻譯功能即肽鏈合成時聚合成整體，為蛋白質(zhì)的合成提供場所。

mRNA

攜帶遺傳信息，在蛋白質(zhì)合成時充當模板的RNA。 ?從脫氧核糖核酸（DNA）轉(zhuǎn)錄合成的帶有遺傳信息的一類單鏈核糖核酸（RNA）。它在核糖體上作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定肽鏈的氨基酸排列順序。

核糖體：

容納mRNA，并能沿著mRNA由5’——3’ 移動，由tRNA解讀其密碼；氨基酰位點（A位點），可結(jié)合氨基酰-tRNA（AA-tRNA）；肽?；稽c（P位點），可結(jié)合肽?；?tRNA（肽-tRNA）；

肽?；D(zhuǎn)移酶中心，是形成肽鍵的位點等。

起始因子（IF）:翻譯起始所需要的催化性蛋白質(zhì)。促使核糖體和mRNA正確結(jié)合?

延伸因子（EF）:蛋白質(zhì)合成過程，幫助進入的氨基酸殘基與肽鏈之間形成?；闺逆湹靡匝娱L的一類蛋白質(zhì)因子。

釋放因子（RF）：識別終止密碼子引起完整的肽鏈和核糖體從mRNA上釋放的蛋白質(zhì)?

翻譯起始時，第一個氨基酸一般是蛋氨酸，其氨基要甲?；枰员Ｗo。氨基酰tRNA進入A位肽鍵的形成蛋白質(zhì)合成的終止肽鏈的延伸

2.核酸技術(shù)

（1）PCR技術(shù)的基本原理：

PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復性）和延伸3個步驟的反復循環(huán)（25～30次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴增。

DNA模板的熱變性：將待擴增DNA加熱到94℃左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并

游離于反應體系中作為模板。

模板與引物的結(jié)合（退火或復性）：將體系溫度降至合適溫度（52℃左右），使加

入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補結(jié)合。

引物延伸：將體系溫度升到72℃左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補原則連接在

DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補的新鏈。

參數(shù)

變性溫度與時間：一般選擇： 94℃，30秒

退火溫度與時間：取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇為Tm - 5℃

延伸溫度與時間：一般選擇： 70℃ ～75℃

循環(huán)次數(shù)：取決于模板濃度， 一般循環(huán)：30次

[引物是根據(jù)已知序列的模板DNA待擴增區(qū)兩端而設(shè)計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為15～30個堿基。

RNA作為模板時，需要：RNA cDNA PCR, 稱此為RT-PCR]

（2）Southem印跡雜交法(Southern blot hybridization)

又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測等，亦可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。

提取DNA→限制性內(nèi)切酶酶切→瓊脂糖凝膠電泳→DNA用堿變性→變性的DNA轉(zhuǎn)移

到硝酸纖維素膜→加入DNA探針→顯影或顯色檢測雜交信號→證實DNA靶分子是

否含有目的基因片段。

???Northem印跡雜交法(Northern blot hybridization)

又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平以及比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。

（1）檢測mRNA長度分子量大?。ㄒ离娪具w移率估計）；

（2）mRNA的含量，即基因表達高低。（密度掃描儀，定量分析）

Northern雜交用于鑒定RNA。其基本原理與Southern雜交相同，只不過變件方法不能采用堿變性法，因為堿導致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亞礬、甲醛、甲基氫氧化汞等變性方法。

[分子印跡技術(shù)-特點

1.預定性，即它可以根據(jù)不同的目的制備不同的MIPs，以滿足各種不同的需要。 　　

2.識別性，即MIPS是按照模板分子定做的，可專一地識別印跡分子。 　　

3.實用性，即它可以與天然的生物分子識別系統(tǒng)如酶與底物、抗原與抗體、受體與激素相比擬，但由于它是由化學合成的方法制備的，因此又有天然分子識別系統(tǒng)所不具備的抗惡劣環(huán)境的能力，從而表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性和長的使用壽命.]

（3）DNA測序（雙脫氧法原理）

原理利用了DNA聚合酶所具有的兩種催化反應特性：第一，DNA聚合酶能以單鏈DNA

為模板，準確合成出DNA的互補鏈；第二，DNA聚合酶能以2′,3′-雙脫氧核苷三磷酸

為底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3′-末端，從而終止DNA鏈的延長。[在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶. 測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸(稱為ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后進行聚合反應. 在第一個反應物中, ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈, 由于其3位的羥基變成了氫, 所以不能繼續(xù)延伸. 所以第一個反應中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了; 同理第二個反應產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的; 第三個反應的都以G結(jié)尾, 第四個反應的都以T結(jié)尾, 電泳后就可以讀出序列了]

3.基因表達的特點（時空特異性）

基因表達(gene expression)是指基因的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯等極其復雜的生物化學反應，最終產(chǎn)生具有生物功能的蛋白質(zhì)的過程，即DNA→RNA→蛋白質(zhì)。

基因表達是受調(diào)控的

時間特異性

按功能需要，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性(temporal specificity)。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stage specificity)。

空間特異性

基因表達伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cell or tissue specificity)。在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達的空間特異性(spatial specificity)。

4.分子克?。?/p>

(1)?典型的基因重組（切，接，轉(zhuǎn)，增，檢）

應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA ?。

① DNA的體外重組（切、接）② 重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和篩選（轉(zhuǎn)、增）③ 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）

載體和目的基因的分離；載體和目的基因的切割；載體和目的基因的重組；重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴增；重組DNA的篩選和鑒定。

"分"是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲重組的目的DNA（① 直接分離目的基因；② 通過化學合成法和PCR（聚合酶鏈式反應）擴增法（又稱酶促合成法）獲得基因；③ 通過構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，從中篩選目的基因）；"切"是指用序列特異的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和目的基因；"接"是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；"轉(zhuǎn)"是指通過特殊的方法（原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法、化學轉(zhuǎn)化法、電穿孔轉(zhuǎn)化法）將重組的DNA分子送入宿主細胞中，使原來細胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應變化的現(xiàn)象，“增”進行復制和擴增；"檢"則是從宿主群體中通過方法（抗生素抗性篩選、β-半乳糖苷酶插入失活型篩選、營養(yǎng)缺陷型篩選、原位雜交法篩選、Southern印跡法篩選、限制性酶切法篩選、蛋白質(zhì)生物學功能法篩選、免疫沉淀法篩選、聚丙烯酰胺凝膠電泳法篩選）挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。

?(2)DNA分子體外連接技術(shù)

?黏性末端DNA片段的連接

DNA連接酶能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。應用

DNA連接酶可在體外將具有黏性末端的DNA限制片段，插入到適當?shù)妮d體分子上，從而可能按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子

平頭末端DNA片段的連接

T4DNA連接酶法：可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應需ATP作為輔助因子。

同聚物加尾法：應用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账峒拥紻NA分子單鏈延伸末端的3’ -OH基團上，它并不需要模板鏈的存在，它一個一個加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴。需用5’特異的核酸外切酶處理平末端的DNA分子上產(chǎn)生帶5’ -OH的單鏈延伸。

化學合成的銜接物連接DNA分子：銜接物(1inker)，是指用化學方法合成的一段由10-12個核苷酸組成的，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的寡核苷酸片段。

?(3)藍白斑篩選原理

β-半乳糖苷酶插入失活型篩選

載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和篩選，當有外源基因插入該顯色基因后，其顯色反應消失。【藍白篩選原理：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點的DNA序列。這些位點上如果沒有克隆外源性DNA片段，在質(zhì)粒被導入lac-的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和誘導劑IPTG后，出現(xiàn)藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lac Z基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由于這種顏色標志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然?！?/p>

（4）工具酶是什么？常用的工具酶有哪些？

工具酶（tool enzymes） ：指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。

工具酶的種類:

①
?限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonadease)【Ⅰ、Ⅲ型它們識別與切割順序不在一個地方，不產(chǎn)生特異性的DNA片段，與基因工程意義不大。Ⅱ型也就是基因工程說到的限制酶核酸內(nèi)切酶，Ⅱ型酶分子量小，僅需Mg2+作為催化反應的輔因子，識別與切割位點相同，產(chǎn)生特異的DNA片段。同裂酶:指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。同尾酶:指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶】、② DNA連接酶（DNA ligase)【催化有互補順序的兩個dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′-OH、5′-P連接作用?！?、③逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)[逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它的酶活性有：逆轉(zhuǎn)錄酶：以mRNA為模板合成cDNA；DNA依賴DNApol：以ssDNA為模板，3-OH DNA片段為引物，合成DNA鏈。RnaseH ：外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA雜交分子RNA鏈，有兩種：①5′→3′外切RNA，稱5′→3′外切RNA酶；② 3′→5′外切RNA，稱3′→5′外切RNA酶，也稱RnaseH。]、④DNA聚合酶(DNA polymerase)[① 5 ’ →3 ’聚合活性；② 3 ’ →5 ’外切酶活性；③ 在無dNTP時，可以從任何3 ’ -OH端外切；④ 在只有一種dNTP時，外切至互補核苷暴露時為止；⑤ 在有4種dNTP均存在時，聚合酶活性占主導地位。]、⑤核酸酶(nuclease)[① 降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的單或寡核苷酸，對DNA活性強于>RNA;② 中量S1可從切口或小缺口處降解dsDNA;③ 極大量的S1才能降解dsDNA或DNA-RNA雜交鏈，原因是后者對S1降解有抗性，所以S1又稱單鏈特異的核酸酶。]、⑥末端轉(zhuǎn)移酶[① 催化一個單核酸（dNTP）加到另一個DNA分子的3’－OH末端；② 平端或帶延伸3’－OH末端的dsDNA需要Co2＋存在才能作模板，](terminal transferase)、⑦堿性磷酸酶[① 去除DNA、RNA和dNTP的5’磷酸根；② 去除5’p ，防止DNA片段或載體自身環(huán)化。③ 32p標記5’p末端前，先用其去除DNA或RNA上的5’p](BAP或CIP)。

（5）在分子克隆中要作為載體需要哪些條件？

要把一個有用的基因（目的基因-研究或應用基因）通過基因工程手段送到生

物細胞（受體細胞），需要運載工具攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載

工具就叫做載體（vector）

載體所具備的特征① 能在宿主細胞中大量復制，得到大量的重組DNA分子；② 載體上的內(nèi)切酶位點對于一種酶來說只能有一個（置換型載體上被置換片段的兩側(cè)各有一個內(nèi)切酶位點）；③ 克隆載體要有復制起點，表達載體要有啟動子④ 載體上要有報告基因或選擇標記基因⑤ 在不影響載體復制和表達的DNA序列上有內(nèi)切酶酶切位點⑥ 具有較高的外源DNA裝載能力。

5.限制性核酸內(nèi)切酶3’5’端的標記，再用DNA聚合酶聚合，末端有何變化？再用DNA連接酶連接，再酶切，是否能形成相同的末端？

Ⅱ型酶識別的特殊DNA序列稱為限制酶的識別位點（或切割位點）。它能識別dsDNA的4~6bp的回文序列并水解該部分的核苷鍵。一般來說是4~6bp，有6個以上的，但沒有4個以下的。識別順序呈二重對稱，即180°旋轉(zhuǎn)對稱。

形成平頭末端（bluntend）PvuⅡⅠ等形成的平頭末端

粘性末端（sticky end）：限制酶切割產(chǎn)生2個突出的末端稱之，作用是放在一起自發(fā)形成雙鏈。

6.應用（判斷動物功能，DNA分子體外重組，體外表達的過程）

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