代謝組學一般根據(jù)以下四個維度對代謝物鑒定的可信度進行劃分：可靠的鑒定得到的化合物（1級），通過假定注釋得到的化合物（2級），通過假定注釋對化合物類別進行鑒定（3級）和未知化合物（4級）。1級鑒定需要將目標代謝物的兩個或多個正交特性（如保留時間、m/z和碎片質(zhì)譜）與在相同分析條件下觀察到的真實化學標準品的相同特性進行比較。推定（第2級或第3級）注釋基本上僅依賴于一個或兩個特性，且通?；趯Σ煌瑢嶒炇沂占囊约安煌治龇椒ǐ@得的數(shù)據(jù)的比較，而不是在相同分析條件下與真正的化學標準品的直接比較。

未知代謝物指可以反復檢測到的但其化學身份尚未確定的小分子。這些化合物雖然尚未被鑒定和分類，但在代謝組學實驗中仍可根據(jù)光譜數(shù)據(jù)進行區(qū)分和定量。在LC-MS實驗中，一個未知化合物將由唯一的保留時間、一個或多個質(zhì)量或一個特定的初級離子碎片模式定義。在NMR實驗中，一個未知化合物將由化學位移的模式定義。未知物可能代表先前沒有被識別的小分子，例如代謝的次級產(chǎn)物或罕見的外源性物質(zhì)，或者它們可能由已建立的途徑構(gòu)成分子但無法分配到現(xiàn)有的NMR參考譜庫或MS碎裂模式。

未知化合物的鑒定非常耗時且成本高昂，通常需要進行制備規(guī)模的分離以進行NMR研究，或大量的化學合成才能使用MS/MS進行結(jié)構(gòu)比較。因此，大多數(shù)報告都集中于檢測具有可用的真實商業(yè)標準品或至少存在于代謝物數(shù)據(jù)庫中的代謝物，即分類為1級，2級和3級的代謝物。由于許多代謝物固有的不穩(wěn)定性和需求的缺乏，僅有數(shù)千種商業(yè)分析標準品可用。然而，這些標準品和數(shù)據(jù)庫中存在的代謝物僅占內(nèi)源性代謝物很小的一部分。因此，對于代謝組學研究來說，有效的方法來排序、研究和最終鑒定非特征代謝物是非常重要的。未知代謝物的成功鑒定將對生物標志物的發(fā)現(xiàn)和組學研究產(chǎn)生重大影響。

為了鑒定代謝組學樣品中的未知化合物，應(yīng)區(qū)分不同類別的代謝物，具有相同可分辨公稱質(zhì)量（nominal mass）的，具有相同可分辨公稱質(zhì)量但分子式和同位素質(zhì)量不同的，相同可分辨公稱質(zhì)量和同位素質(zhì)量但化學結(jié)構(gòu)不同的，都應(yīng)該對其進行區(qū)分。例如，亮氨酸和異亮氨酸是結(jié)構(gòu)不同的異構(gòu)體，但是可分辨公稱質(zhì)量和同位素質(zhì)量相同。此外，由于單一代謝物可以在質(zhì)譜儀中檢測到不同的衍生物種，所以正確地將不同的衍生物種分配給母體代謝物也是很重要的。例如，在氨基酸分析中，三甲基硅烷化（TMS）與氨基酸發(fā)生化學衍生反應(yīng)會生成含有1、2或3個TMS基團的氨基酸，這些氨基酸都應(yīng)屬于同一母體氨基酸。