前言

玉米是最重要的作物之一，主要用于糧食供應(yīng)、牲畜飼料和工業(yè)。由于易受缺水的影響，其生產(chǎn)力受到干旱壓力的嚴(yán)重限制。許多蛋白質(zhì)將通過(guò)蛋白磷酸酶(PPs)催化的去磷酸化而被激活或失活(Cohen，1989)。根據(jù)其底物特異性，PPs主要分為三個(gè)家族，即絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)特異性磷酸化蛋白磷酸酶(PPP)、金屬依賴蛋白磷酸酶(PPM)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。PPP和PPM家族編碼絲氨酸/蘇氨酸 PP，而PTP家族包括酪氨酸特異性和雙特異性磷酸酶。PP2C的A亞類成員作為脫落酸(ABA)的共受體，與ABA受體蛋白PYR/PYL/PCAR和SNF1相關(guān)蛋白激酶2s(SnRK2s)負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)，并在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和刺激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2022年4月，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)付鳳玲/于好強(qiáng)教授課題組在《Frontiers in Plant Science》期刊發(fā)表了題為的研究成果，運(yùn)用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的B亞類成員，命名為，并分析其活性、定位和相互作用的蛋白。通過(guò)轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻表型以及玉米突變體確定了其在耐旱性方面的功能。數(shù)據(jù)表明，通過(guò)去磷酸化ZmMAPK3/ZmMAPK7和損害玉米的光合作用來(lái)負(fù)調(diào)控抗旱性。

中文標(biāo)題：ZmPP2C26選擇性剪接變異負(fù)調(diào)控玉米的抗旱性

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science

影響因子：6.627?

作者單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

運(yùn)用生物學(xué)技術(shù)：磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（由歐易/鹿明生物提供技術(shù)支持）

研究背景

在擬南芥中，PP2C的6個(gè)B分支B成員中的3個(gè)，包括AP2C1、AP2C3和PP2C5，它們?cè)跉饪装l(fā)育、免疫、防御和K+缺陷反應(yīng)中的功能得到了闡明。煙草B亞類成員NtPP2C2b被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)尼古丁的生物合成。然而，PP2C的B亞類成員在作物中的功能尚不清楚。

研究思路

（點(diǎn)擊查看大圖）

實(shí)驗(yàn)方法

研究材料：耐旱玉米自交系81565/87-1、干旱自交系200B/DAN340

1.磷酸酶活性測(cè)定

2.酵母雙雜交，雙分子熒光互補(bǔ)，和GST Pull-Down

3.亞細(xì)胞定位和共定位

4.磷酸化試驗(yàn)

5.轉(zhuǎn)基因擬南芥、水稻和玉米突變體的表型分析

6.TMT標(biāo)記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

研究結(jié)果

1、第一外顯子產(chǎn)生的兩個(gè)突變類型

在基因克隆過(guò)程中，作者利用一對(duì)引物擴(kuò)增了兩個(gè)AS變體，定義為和 (圖1A)。序列比對(duì)結(jié)果顯示，與相比，的第一個(gè)外顯子保留了213 bp。剪接位點(diǎn)為5’CC……GC-3’，既不是U2型，也不是U12型，而是一種新的AS類型AFE （可變的第一個(gè)外顯子）(圖1B)。蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示，被保留的71 aa具有高度保守的MAPK相互作用基序KIM Motif (圖1C)，這意味著可能與一些ZmMAPK成員相互作用。

圖1 |通過(guò)AFE型的剪接變體

2、剪接變異體與ZmMAPK3和ZmMAPK7相互作用

為了探討/是否參與了ABA和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，作者采用Y2H實(shí)驗(yàn)測(cè)定了它們與13個(gè)ZmPYLs和20個(gè)ZmMAPKs的相互作用。結(jié)果顯示，/與13個(gè)ZmPYLs均無(wú)相互作用。然而，在X-α-Gal的四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade/)SD板上，AD-ZmPP2C26L和BD-ZmMAPK3/BD-ZmMAPK7、ADZmPP2C26S和BD-ZmMAPK3共轉(zhuǎn)化的酵母菌株以及陽(yáng)性對(duì)照(即AD-T和BD-53) 可以生長(zhǎng)良好并染成藍(lán)色 (圖2A）。

GST Pull-down結(jié)果顯示，His-ZmPP2C26L被GST-ZmMAPK3/-ZmMAPK7拉下，而His-ZmPP2C26S僅被GST-ZmMAPK3拉下(圖2B)。BiFC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，nYFP-ZmPP2C26L和cYFP-ZmMAPK3/cYFP-ZmMAPK3/cYFP-ZmMAPK7共表達(dá)以及nYFP-ZmPP-ZmPP2C26S和cYFP-ZmMAPK3共表達(dá)可以產(chǎn)生較強(qiáng)的YFP熒光信號(hào)(圖2C)。

這些結(jié)果證實(shí)了與ZmMAPK3和ZmMAPK7發(fā)生相互作用，而僅在體內(nèi)外與ZmMAPK3相互作用。

圖2 |?/與ZmMAPK3/ZmMAPK7的相互作用

3、ZmPP2C26去磷酸化ZmMAPK3和ZmMAPK7

為了檢測(cè)/是否去磷酸化ZmMAPK3/ZmMAPK7，作者在體外進(jìn)行了去磷酸化實(shí)驗(yàn)。如圖3所示，在Phos-TagTM SDS-PAGE凝膠上沒(méi)有或的情況下，僅能檢測(cè)到磷酸化ZmMAPK3/-ZmMAPK7。然而，當(dāng)HA-ZmMAPK3/HA-ZmMAPK7與His-ZmPP2C26L孵育，HA-ZmMAPK3與His-ZmPP2C26S孵育時(shí)，檢測(cè)到去磷酸化的ZmMAPK3/ZmMAPK7。

值得注意的是，隨著濃度的增加，磷酸化的ZmMAPK3/phoshoZmMAPK7蛋白的表達(dá)量降低。

圖3 |?體外去磷酸化實(shí)驗(yàn)

4、ZmPP2C26L/ZmPP2C26S的亞細(xì)胞定位

為了確定的亞細(xì)胞定位，將其ORF在35S啟動(dòng)子的控制下與eGFP融合，在本式煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)。共聚焦激光掃描顯微鏡顯示，ZmPP2C26L-eGFP在葉綠體和細(xì)胞核中被檢測(cè)到熒光信號(hào)，而ZmPP2C26L-eGFP在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中被檢測(cè)到熒光信號(hào) (圖4A)。

共定位也顯示與在細(xì)胞核中共定位，與共定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖4B)。這些結(jié)果表明 和 的功能可能有所不同。

圖4 |?亞細(xì)胞定位和共定位

5、和負(fù)調(diào)控耐旱性

如圖5所示，在干旱脅迫2周后，轉(zhuǎn)基因株系的干旱敏感性增強(qiáng)，而野生型幼苗則出現(xiàn)了輕微的枯萎病。L1、L2、S1和S2兩株系的存活率分別為44.5、54.3、5.2和6.0%，均顯著低于WT（90.8%）。在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)明顯短于野生型。在最佳條件下，L1和L2株系的葉綠素含量和光合速率均顯著低于WT。S1和S2品系與WT相比無(wú)顯著性差異。

如圖6所示，的Mu轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致RT-PCR鑒定的被敲除。與野生型相比，具有耐旱表型。干旱脅迫后，的存活率為87.5%，而野生型僅為12.5%。的根長(zhǎng)和根干重也顯著高于WT。突變體的葉綠素含量和光合速率均顯著高于WT。

以上結(jié)果表明，負(fù)調(diào)控抗旱性，且變異對(duì)干旱的敏感性高于。

圖5 | 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻株系的表型分析

圖6 | 干旱脅迫下玉米的表型分析

6、改變蛋白磷酸化水平

KEGG富集途徑分析顯示，影響的磷酸化蛋白主要富集于光合作用中，而影響的磷酸化蛋白與光合作用和丙酮酸代謝中的碳固定有關(guān)（圖7）。

圖7 | 轉(zhuǎn)基因水稻的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了一組受影響的磷酸化蛋白

在中，分別有324個(gè)和347個(gè)磷酸化蛋白表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。由于是一種PP，因此在植株中，由于其靶點(diǎn)的磷酸化水平應(yīng)該有所提高。KEGG通路分析表明，上調(diào)的磷酸化蛋白在多種途徑中富集，但主要參與光合作用（圖8）。

圖8 | 突變體的|磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出受影響的磷酸化蛋白

圖9 | 描述選擇性剪接變異負(fù)調(diào)控耐旱性

研究結(jié)論

1. 作者鑒定了一個(gè)B型2CPP分支，即，其通過(guò)非典型的AS，可產(chǎn)生了兩個(gè)亞型。

2. 直接使ZmMAPK3和ZmMAPK7去磷酸化，從而負(fù)調(diào)控干旱脅迫和光合作用活性。

   
   

小鹿推薦

本研究為了揭示對(duì)蛋白磷酸化的整體影響，利用基于TMT的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析過(guò)表達(dá)株系，探索脅迫相關(guān)基因?qū)⒂兄诖龠M(jìn)分子設(shè)計(jì)育種，提高玉米的抗旱性，為PP2C響應(yīng)非生物脅迫的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

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