新方法可以這樣來研究星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用機(jī)制
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞間相互作用在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要作用。然而，對所涉及的特定分子途徑知之甚少，其系統(tǒng)鑒定方法也有限。在CNS駐留的膠質(zhì)細(xì)胞的異常相互作用會導(dǎo)致幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如多發(fā)性硬化（MS）和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）。星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用有可能確定神經(jīng)系統(tǒng)疾病的候選治療靶點(diǎn)。然而，目前的方法沒有將細(xì)胞間相互作用與分子狀態(tài)的因果聯(lián)系起來，因此亟需有效的方法來檢測由表面或分泌因子介導(dǎo)的短暫細(xì)胞間相互作用。
正向遺傳篩選平臺，如基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的平臺，是識別控制感興趣生物過程基因的有力工具。然而，由于無法通過高通量共培養(yǎng)和受干擾單細(xì)胞的篩選，限制了其應(yīng)用。研究細(xì)胞通訊的正向遺傳篩選平臺需要在受控微環(huán)境中建立由表面或分泌因子介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用。它還需要檢測由這些相互作用產(chǎn)生的現(xiàn)象，以及表型與特定CRISPR-Cas9誘導(dǎo)之間的關(guān)聯(lián)。
近日，美國波士頓哈佛醫(yī)學(xué)院布里格姆婦女醫(yī)院Francisco J. Quintana教授研究團(tuán)隊(duì)在Science發(fā)表研究，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一個正向遺傳篩選平臺（SPEAC-seq），該平臺結(jié)合了CRISPR-Cas9干擾、皮升微滴中的細(xì)胞共培養(yǎng)和基于微流體的熒光激活微滴分選，可以確定細(xì)胞與細(xì)胞間的通信機(jī)制。
1. 基于微滴的正向遺傳細(xì)胞間相互作用篩選平臺的開發(fā)
首先，使用兩種水性懸浮液（每種細(xì)胞類型一種）和油的微流體共流用于產(chǎn)生皮升的含有細(xì)胞對的油包水液滴，并通過使用定制的三色光學(xué)系統(tǒng)和介電泳微流體分選機(jī)進(jìn)行檢測和分選[Fig.1B,C]。同時，開發(fā)并驗(yàn)證了一種用于加載和檢測微滴中細(xì)胞對的系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用細(xì)胞滲透熒光染料進(jìn)行多重標(biāo)記[Fig.1D,E]?？偟膩碚f，研究人員初步建立了用于研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的微滴微流體平臺。
Figure 1 皮升液滴容器中細(xì)胞間相互作用的檢測
2. SPEAC測序鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的信號傳導(dǎo)
接下來，基于微滴的共培養(yǎng)系統(tǒng)與CRISPR-Cas9干擾相結(jié)合，建立了SPEAC-seq，這是一個用于調(diào)控細(xì)胞間相互作用的正向遺傳篩選平臺。并基于此來鑒定參與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-kB活化的小膠質(zhì)細(xì)胞因子[Fig.2A-C]。
Figure 2 SPEAC seq確定了限制星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞因子
為了關(guān)注參與控制細(xì)胞-細(xì)胞間通信調(diào)節(jié)途徑的候選蛋白，研究人員鑒定了小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的四種候選生長因子（Areg、Nrtn、Fgl1和Pnoc），它們通過星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的四種獨(dú)立受體（表皮生長因子受體[Egfr]、Lag3、Gfra2、Oprl1）發(fā)出信號[Fig.2H,I]。
為了進(jìn)一步評估SPEAC-seq揭示的每個候選途徑在炎癥中的調(diào)節(jié)作用，應(yīng)用了細(xì)胞類型特異性的體內(nèi)Perturb-seq方法。在EAE模型中發(fā)現(xiàn)，Egfr靶向?qū)е翴L-1b/TNFa信號的激活最強(qiáng)，其促進(jìn)與EAE和MS相關(guān)的NF-kB驅(qū)動的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。SPEAC-seq鑒定的EGFR配體是Areg，它編碼雙調(diào)節(jié)蛋白（amphiregulin）?？傊∧z質(zhì)細(xì)胞分泌的AREG通過星膠EGFR受體抑制星膠的促炎反應(yīng)[Fig.3]。
Figure 3 小膠質(zhì)細(xì)胞AREG限制星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎反應(yīng)
3. 星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生的IL-33誘導(dǎo)ST2+小膠質(zhì)細(xì)胞AREG表達(dá)
最后，研究人員探索在EAE期間誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞Areg表達(dá)的CNS病理學(xué)原因。已有研究確定IL-33是EAE的抑制劑和Areg表達(dá)的誘導(dǎo)劑。重新分析RABID seq數(shù)據(jù)確定星形膠質(zhì)細(xì)胞觸發(fā)的IL-33信號傳導(dǎo)是EAE期間Areg+小膠質(zhì)細(xì)胞的假定上游調(diào)節(jié)因子。表明星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的IL-33誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Areg，然后作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞以抑制疾病促進(jìn)反應(yīng)，這是一個負(fù)反饋調(diào)節(jié)[Fig.4]。
總之，這些發(fā)現(xiàn)確定了一個由雙調(diào)節(jié)蛋白和IL-33-ST2（IL-33受體）信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，這限制了EAE中由小膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用驅(qū)動的CNS病理。
Figure 4 IL-33-ST2信號控制星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)回路
總結(jié)與展望
本文中報告了SPEAC-seq的開發(fā)，這是一個基于微流體、微滴中的細(xì)胞共培養(yǎng)、CRISPR-Cas9基因干擾和微滴分選的平臺，該平臺能夠?qū)崿F(xiàn)識別細(xì)胞通信機(jī)制的正向遺傳篩選。研究人員使用SPEAC-seq，結(jié)合體內(nèi)遺傳干擾，在EAE模型和臨床樣本中，確定了小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的雙調(diào)節(jié)蛋白作為疾病促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的抑制劑。
本研究開發(fā)了一種定義細(xì)胞-細(xì)胞通訊分子機(jī)制的新方法，并將IL-33-ST2信號確定為小膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞中限制CNS病理的回路。
在未來的應(yīng)用中，SPEAC-seq可以與表觀基因組或轉(zhuǎn)錄組的全基因組分析相結(jié)合，以研究它們通過細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，或者與抗體或小分子條形碼庫相結(jié)合，識別細(xì)胞-細(xì)胞通信的治療調(diào)節(jié)劑，具有重要價值和廣闊的前景。
參考文獻(xiàn)：
Wheeler, Michael A et al. “Droplet-based forward genetic screening of astrocyte-microglia cross-talk.”Science (New York, N.Y.) vol. 379,6636 (2023): 1023-1030. doi:10.1126/science.abq4822
編譯作者：Young（brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì)）
校審：Simon（brainnews編輯部）
