之前介紹了如何選擇研究的miRNA（文章名稱：《研究miRNA，到底是研究5p成熟體還是3p成熟體呢？》）以及miRNA表達量的檢測方法（文章名稱：《莖環(huán)法or加尾法？哪種更適合你的miRNA檢測？》），這次小編來講講miRNA過表達和干擾的常用研究方法。

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miRNA作用機制

miRNA首先在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄出較長的初級miRNA（pri-miRNA），然后在細胞核內(nèi)由Drosha加工成前體miRNA（pre-miRNA），在Exprotin?5復合物的幫助下被轉(zhuǎn)運出細胞核，在細胞質(zhì)中由Dicer剪切成為成熟的miRNA（mature-miRNA），隨即被整合進RNA沉默復合物（RISC）中，基于與mRNA完全或不完全配對來調(diào)節(jié)基因表達。

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圖1 miRNA作用機制

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miRNA過表達

研究miRNA過表達通常有三種方法：（1）根據(jù)pri-miRNA序列構(gòu)建過表達載體，選擇pre-miRNA上下游在內(nèi)的300bp以內(nèi)的序列克隆到啟動子下游；（2）根據(jù)mature-miRNA序列構(gòu)建過表達載體，將mature-miRNA序列及其反向互補序列加上loop序列構(gòu)建到載體上；（3）直接化學合成小片段mimics（mature-miRNA序列）。

其中，根據(jù)pri-miRNA序列構(gòu)建過表達載體，載體轉(zhuǎn)入細胞或?qū)嶒瀯游矬w內(nèi)后可利用miRNA加工機制獲得成熟的miRNA并發(fā)揮作用，過表達效果較好，是最常用的一種過表達方法。

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表1 miRNA過表達的研究方法

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miRNA干擾

研究miRNA干擾通常有三種方法：（1）antango，合成mature-miRNA序列的反向互補序列構(gòu)建到載體上；（2）sponge，一般是將4個mature-miRNA序列的反向互補序列用linker連接，合成相應(yīng)序列，構(gòu)建到載體上；（3）inhibitor，直接化學合成mature-miRNA反向互補序列。

sponge有多條mature-miRNA反向互補序列，相比單條序列，干擾效率更高，且II/III型啟動子均可啟動，使用范圍更加廣泛，是最常用的干擾方法。

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表2 miRNA干擾的研究方法

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注：由于miRNA干擾只是利用反向互補序列吸附miRNA，而非讓miRNA降解，所以miRNA依然存在，使用qPCR檢測其表達量沒有變化是正?，F(xiàn)象，可通過檢測與其相互作用的靶基因的表達量來判斷miRNA表達量是否下降。

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