寫在前面

????????今天推薦的是由北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院在2019年8月19日發(fā)表于Nucleic Acids Research（2020IF：16.971，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Luyang Sun教授，研究表明USP11作為組蛋白去泛素酶在DNA修復過程中發(fā)揮染色質重組的作用。

研究背景

????????真核細胞進化出高效的DNA修復系統(tǒng)，以引導基因組的完整性，進而應對外源性和內(nèi)源性的DNA損傷。未修復或錯誤修復的DNA損傷可導致斷裂位點的嚴重染色體重排或突變，最終導致腫瘤發(fā)生、炎癥性疾病和衰老。如何調(diào)節(jié)染色質動力學以確保有效的DNA修復仍有待探究。

摘要部分

????????在這里，作者報告了泛素特異性蛋白酶USP11作為組蛋白去泛素化酶催化H2AK119和H2BK120去泛素化。作者發(fā)現(xiàn)USP11與染色質重塑NuRD復合物在物理上相關，并在功能上參與DNA修復過程。作者證明了USP11介導的組蛋白去泛素化和NuRD相關的組蛋白去乙?；瘏f(xié)調(diào)，以允許及時終止DNA修復和染色質結構的重組。因此，USP11參與染色質凝聚、基因組穩(wěn)定性和細胞存活?？傊@些觀察結果表明USP11是一種染色質修飾劑，在DNA損傷反應和維持基因組穩(wěn)定性方面起著至關重要的作用。

研究內(nèi)容

1.USP11作為組蛋白去泛素化酶催化H2AK119和H2BK120去泛素化

????????組蛋白修飾如泛素化和隨后的DNA修復蛋白募集是響應DNA損傷的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的組成部分，并且許多DUB與DNA修復過程有關。作者使用了81個siRNA庫來單獨敲低HeLa細胞中的每個相應的DUB。通過成像系統(tǒng)檢查細胞中H2BK120ub和53BP1IRIF形成的免疫熒光強度，顯示幾個DUB的陽性結果。有趣的是，H2BK120ub的平均免疫熒光強度在USP11敲低后顯著增加。通過western blot分析獲得了類似的結果。同時，對 siDUBs處理的HeLa細胞中53BP1的IRIF形成的分析表明， USP11、USP12、USP14、USP15 或USP37 的敲低都導致53BP1IRIF增加。這些觀察結果表明，USP11可能通過靶向H2BK120ub與DDR相關聯(lián)。

????????用針對泛素化H2AK15、H2AK119或H2BK120的抗體對酸提取的組蛋白進行western blot分析，組蛋白中的普遍泛素化位點表明USP11敲低導致H2AK119ub 和H2BK120ub 的水平增加，而USP11過表達導致H2BK120和H2AK119的泛素化水平降低。H2AK15ub的水平?jīng)]有觀察到明顯的變化。為了支持USP11在功能上與去除H2AK119和H2BK120泛素化有關的觀點，作者通過定點誘變創(chuàng)建了一個USP11突變體USP11/C318S。從HEK293T細胞中提取的組蛋白的蛋白質印跡分析顯示，野生型USP11的過表達導致H2BK120ub 和H2AK119ub 水平的顯著降低，而USP11/C318S 的過表達對H2BK120ub 和H2AK119ub 的水平?jīng)]有明顯影響。此外，用細菌表達的 GST-USP11或 GST-USP11/C318S 和小牛胸腺組蛋白進行的體外去泛素化分析，然后進行蛋白質印跡分析表明，野生型USP11可以以劑量依賴性方式有效地從H2BK120和H2AK119中去除泛素，而非USP11/C318S。

研究結論：USP11通過其去泛素化酶活性催化H2BK120和H2AK119去泛素化。

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2.USP11與NuRD復合物發(fā)生物理相互作用? ? ?

????????作者接下來采用親和純化和質譜法在體內(nèi)探究USP11相互作用物。為此，HEK293T細胞被FLAG標記的USP11穩(wěn)定轉染。含USP11的蛋白質復合物的質譜分析表明，USP11與 MTA2、HDAC2、RbAp46/48、核小體重塑和脫乙酰酶的所有成分共同純化（NuRD) 復合體。免疫共沉淀 (IP)實驗結果也證實了這一點。進一步的 co-IP 實驗還證實了USP11與NuRD組件的相互作用。此外，USP11的洗脫模式與包括 Mi-2、MTA2、HDAC1/2、RbAp46/48 和 MBD3 在內(nèi)的NuRD復合蛋白的洗脫模式在很大程度上重疊?？傊?，這些結果支持USP11/NuRD復合物在體內(nèi)的存在。

????????為了進一步鞏固USP11和NuRD復合物之間的相互作用，使用細菌表達的USP11和NuRD復合物進行了 GST 下拉測定。實驗表明USP11能夠直接與MTA2、HDAC2和MBD3相互作用，但不能與作者測試的NuRD復合物的其他成分相互作用。

研究結論：USP11與NuRD復合物發(fā)生物理相互作用。

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3.USP11/NuRD復合物在DNA損傷時被募集到DNA斷裂位點? ? ?

????????作者接下來研究了USP11如何選擇NuRD復合物參與DNA損傷反應。為此，作者首先探究了DNA損傷后USP11與NuRD復合物的核重新分布的關系。從用X射線IR預處理的HeLa細胞中提取核蛋白，并將其分成無染色質和染色質結合部分，結果檢測到IR觸發(fā)的H2AX 磷酸化。暴露于IR后，可溶性組分中USP11、MTA2和HDAC2的蛋白質水平降低，而它們在染色質結合組分中的積累增加。在IR暴露后，USP11的蛋白質表達增加，并且USP11/NuRD復合物的募集在HEK293T和U2OS細胞中升高。類似地，用烷基化DNA損傷劑甲磺酸甲酯或DNA鏈間交聯(lián)劑絲裂霉素C (MMC) 處理HEK293T細胞導致USP11蛋白穩(wěn)態(tài)水平增加和USP11/NuRD復合物的形成，表明USP11/NuRD復合物在DNA損傷反應中的重要作用。為了進一步證明USP11/NuRD復合物被招募到DSB附近，作者利用DIvA系統(tǒng)，其中用4-羥基他莫昔芬（4OHT）處理會引發(fā)AsiSI內(nèi)切酶的核轉位，從而使DSB在人類基因組的AsiSI靶向序列上被誘導。定量ChIP（qChIP）分析顯示，與H2AX類似，在穩(wěn)定表達HA-AsiSI質粒的U2OS細胞中，4OHT誘導的AsiSI激活后，USP11、MTA2和HDAC2在近端斷裂點周圍富集。如蛋白質印跡所示，AsiSI系統(tǒng)的工作效率通過AsiSI的核定位和響應4OHT的H2AX誘導得到驗證。

????????接下來，對穩(wěn)定表達 GFP-USP11、GFP-MTA2或 GFP-HDAC2的U2OS細胞進行延時成像分析。USP11、MTA2和HDAC2對激光誘導的DNA損傷的富集在10分鐘時觀察到，并在紫外激光微照射后30分鐘達到峰值。此外，在U2OS細胞中較低劑量的激光微輻照和更長的恢復時間測量表明，USP11、MTA2 和 HDAC2與H2AX共定位并在微輻照后1小時共富集激光誘導的DNA斷裂位點。此外，通過免疫熒光顯微鏡進行的Duolink鄰近連接測定 (PLA) 顯示USP11、MTA2和HDAC2共定位于激光造成的DNA損傷軌跡。此外，MTA2或HDAC2的敲低導致USP11的募集減少到激光造成的DNA損傷軌跡，并且USP11敲低阻礙了DSB位點中的NuRD富集，表明USP11和NuRD成分對USP11/NuRD重新定位到DNA損傷位點具有協(xié)同促進作用。

研究結論：USP11/NuRD復合物在DNA損傷時被招募到DNA斷裂位點。

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4.DNA損傷反應中組蛋白去泛素化和去乙?；g的串擾? ? ?

????????為了進一步了解USP11/NuRD復合物在DNA損傷反應中的參與，U2OS細胞在IR后的不同時間點用X射線IR處理組蛋白提取。Western blot分析顯示，H2AK119ub和H2BK120ub的水平在IR暴露后1-4小時達到高峰，此后逐漸下降。然而，當USP11被敲低時，H2AK119ub和H2BK120ub的水平在IR處理后的所有時間點都會增加。有趣的是，USP11敲低導致了H3ac水平的增加和H3ac清除的延遲。用MMC處理也得到類似的結果。這些觀察結果意味著在DNA損傷反應中組蛋白去泛素化和去乙酰化之間存在串擾。U2OS細胞轉染了野生型USP11或去泛素化酶活性缺陷的USP11/C318S突變體，并用DNA損傷試劑喜樹堿（CPT）和依托泊苷處理。結果發(fā)現(xiàn)USP11的過量表達，而不是USP11/C318S，與響應CPT和VP16處理的H2AK119ub和H2BK120ub的水平降低有關。

????????為了進一步了解USP11/NuRD復合物在DNA損傷反應期間的染色質參與情況，通過內(nèi)切酶AsiSI檢測和qChIP分析顯示，USP11敲低阻礙了MTA2和HDAC2在DSBs中的招募，因此在4OHT處理后不僅阻止了H2AK119ub和H2BK120ub的清除，也阻止了DNA斷裂區(qū)周圍H3ac的清除。類似地，HDAC2的敲低與4OHT處理后DSB中與H3ac， H2AK119ub和H2BK120ub的增加有關。同時，野生型USP11的過量表達能夠抵消與內(nèi)源性USP11敲低相關的H2AK119ub、H2BK120ub和H3ac水平的增加，而USP11/C318S的過量表達則沒有這種效果。

研究結論：USP11需要及時清除DNA損傷時DSB位點的組蛋白泛素化和乙?；?，而且USP11這樣做取決于其去泛素化酶的活性，并通過其與NuRD復合物的物理和功能聯(lián)系。

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5.USP11催化的組蛋白去泛素化在DNA損傷反應中的功能意義? ? ?

????????BRCA1和53BP1的IRIF分別代表兩個主要的DSB修復途徑，即HR和NHEJ。為了進一步證明USP11催化的組蛋白去泛素化并探索其在DNA損傷反應中的功能意義，穩(wěn)定敲低USP11的U2OS細胞與對照、USP11或USP11/C318S 質粒共轉染。免疫熒光染色后進行高內(nèi)涵顯微鏡觀察表明，在DNA損傷修復期間，USP11敲低與H2AX、BRCA1和53BP1IRIF的增加有關，表明USP11敲低細胞的修復效率受損。同時，野生型USP11，能夠回補USP11敲低誘導的DNA修復因子的保留，表明USP11對修復因子募集的影響取決于其去泛素化酶活性。為了進一步探究USP11對DDR的影響程度，分別使用基于GFP的染色體報告基因檢測來測量兩種穩(wěn)定細胞系DR-GFP-U2OS和EJ5-GFP-HEK293中的HR或NHEJ修復效率。HR修復效率體現(xiàn)在轉染了內(nèi)切酶I-SceI的U2OS細胞中表達GFP蛋白的細胞百分比。USP11敲除導致GFP陽性的U2OS細胞的相對百分比下降。類似地，與EJ5-I-SceI穩(wěn)定整合的HEK293細胞中USP11的敲低導致GFP陽性細胞的百分比顯著降低，RNF20或BMI1敲低回補了USP11敲低細胞中NHEJ修復的缺陷。

????????然后作者驗證了USP11的去泛素化酶活性是否是其參與DDR所必需的。為此，DR-GFP-U2OS細胞與I-SceI質粒和靶向USP11的siRNA共轉染。FACS分析表明，野生型USP11（而非USP11/C318S）能夠回補因內(nèi)源性USP11耗盡而導致的HR修復效率降低。同樣，USP11的過表達，抵消了USP11敲低細胞中 NHEJ 修復的不足。

研究結論：USP11參與了DNA修復因子的及時分解以及依賴于其去泛素化酶活性的有效 HR和NHEJ修復。

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6.USP11是染色質凝聚和基因組穩(wěn)定性所必需的??? ?

????????鑒于USP11催化的組蛋白去泛素化在DNA損傷反應中的重要作用，作者認為USP11與泛素信號的清除和隨后在DNA修復后期的染色質恢復有關。作者在X射線產(chǎn)生的IR處理下，在USP11敲低U2OS細胞中進行了微球核酸酶（MNase）敏感性試驗。USP11的敲低導致在IR暴露后的所有恢復時間點上，染色質的MNase敏感性明顯增加，這種差異在IR后8小時非常明顯。同時，Mi-2的敲除也導致了染色質可及性的增加，Mi-2和USP11的同時敲除加劇了這種情況。此外，對Giemsa染色的染色體進行分析表明，無論有無CPT處理，敲除USP11都會引起染色體畸變的顯著增加，表明USP11在功能上參與了基因組穩(wěn)定性的維護。作者還探究了USP11對細胞凋亡和對DNA損傷劑的生存的影響。流式細胞儀分析顯示，敲除USP11促進細胞凋亡，而CPT或VP16處理加劇了USP11耗竭誘導的細胞凋亡。同時表達野生型USP11，但不表達USP11/C318S，在一定程度上減輕了USP11耗竭下的細胞凋亡促進作用，表明USP11在細胞凋亡中的作用取決于其酶活性。

????????此外，作者將穩(wěn)定去除USP11的HeLa細胞暴露于不同劑量的X射線紅外。發(fā)現(xiàn)USP11的缺乏與對IR反應的細胞存活率明顯受損有關。作者還發(fā)現(xiàn)RNF20或BMI1的敲低恢復了USP11敲低細胞對IR暴露的敏感性，證明H2BK120和H2AK119去泛素化對USP11介導的細胞生存很重要。同時，USP11敲除對細胞周期曲線沒有明顯的影響，表明USP11對DNA損傷的誘導表型不是由于USP11對整個細胞周期進展的影響。這些結果表明，USP11保護細胞免受基因毒性的傷害，并促進細胞的生存。

研究結論：USP11是一種重要的染色質修飾劑，其作用是保護細胞免受基因毒性的傷害，并有助于染色質的凝聚、基因組的穩(wěn)定和最終的細胞生存。

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結論與討論

????????作者報導USP11是H2AK119和H2BK120的去泛素化酶。同時表明USP11與NuRD復合物在物理上相關，并且在功能上與有效的DNA修復相關。作者還證明USP11可保護細胞免受基因毒性損傷，并且是染色質凝聚、基因組穩(wěn)定性和細胞存活所必需的。

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Thank you!

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原文鏈接：https://europepmc.org/article/MED/31504778