?親和吸附劑選擇制備后，親和層析的其它操作與一般的柱層析基本類似。下面主要介紹親和層析過程中的一些注意事項(xiàng)。

? 1. 上樣

親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短，通常10cm左右。上樣時(shí)應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臈l件，包括上樣流速、緩沖液種類、pH、離子強(qiáng)度、溫度等，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上。

一般生物大分子和配體之間達(dá)到平衡的速度很慢，所以樣品液的濃度不易過高，上樣時(shí)流速應(yīng)比較慢，以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時(shí)間進(jìn)行吸附。特別是當(dāng)配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高、雜質(zhì)較多時(shí)，可以在上樣后停止流動(dòng)，讓樣品在層析柱中反應(yīng)一段時(shí)間，或者將上樣后流出液進(jìn)行二次上樣，以增加吸附量。樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強(qiáng)的親和力。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強(qiáng)度，以減小基質(zhì)、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附。

生物分子間的親和力是受溫度影響的，通常親和力隨溫度的升高而下降。所以在上樣時(shí)可以選擇適當(dāng)較低的溫度，使待分離的物質(zhì)與配體有較大的親和力，能夠充分的結(jié)合；而在后面的洗脫過程可以選擇適當(dāng)較高的溫度，使待分離的物質(zhì)與配體的親和力下降，以便于將待分離的物質(zhì)從配體上洗脫下來。

上樣后用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質(zhì)。平衡緩沖液的流速可以快一些，但如果待分離物質(zhì)與配體結(jié)合較弱，平衡緩沖液的流速還是較慢為宜。如果存在較強(qiáng)的非特異性吸附，可以用適當(dāng)較高離子強(qiáng)度的平衡緩沖液進(jìn)行洗滌，但應(yīng)注意平衡緩沖液不應(yīng)對(duì)待分離物質(zhì)與配體的結(jié)合有明顯影響，以免將待分離物質(zhì)同時(shí)洗下。

? 2. 洗脫

親和層析的另一個(gè)重要的步驟就是要選擇合適的條件使待分離物質(zhì)與配體分開而被洗脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非特異性洗脫。

? ⑴ 特異性洗脫

特異性洗脫是指利用洗脫液中的物質(zhì)與待分離物質(zhì)或與配體的親和特性而將待分離物質(zhì)從親和吸附劑上洗脫下來。

特異性洗脫也可以分為兩種：一種是選擇與配體有親和力的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，另一種是選擇與待分離物質(zhì)有親和力的物質(zhì)進(jìn)行洗脫。前者在洗脫時(shí)，選擇一種和配體親和力較強(qiáng)的物質(zhì)加入洗脫液，這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)配體的結(jié)合，在適當(dāng)?shù)臈l件下，如這種物質(zhì)與配體的親和力強(qiáng)或濃度較大，配體就會(huì)基本被這種物質(zhì)占據(jù)，原來與配體結(jié)合的待分離物質(zhì)被取代而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用凝集素作為配體分離糖蛋白時(shí)，可以用適當(dāng)?shù)膯翁窍疵?，單糖與糖蛋白競(jìng)爭(zhēng)對(duì)凝集素的結(jié)合，可以將糖蛋白從凝集素上置換下來。后一種方法洗脫時(shí)，選擇一種與待分離物質(zhì)有較強(qiáng)親和力的物質(zhì)加入洗脫液，這種物質(zhì)與配體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)待分離物質(zhì)的結(jié)合，在在適當(dāng)?shù)臈l件下，如這種物質(zhì)與待分離物質(zhì)的親和力強(qiáng)或濃度較大，待分離物質(zhì)就會(huì)基本被這種物質(zhì)結(jié)合而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用染料作為配體分離脫氫酶時(shí)，可以選擇NAD+進(jìn)行洗脫，NAD+是脫氫酶的輔酶，它與脫氫酶的親和力要強(qiáng)于染料，所以脫氫酶就會(huì)與NAD+結(jié)合而從配體上脫離。特異性洗脫方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可以進(jìn)一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。另外對(duì)于待分離物質(zhì)與配體親和力很強(qiáng)的情況，使用非特異性洗脫方法需要較強(qiáng)烈的洗脫條件，很可能使蛋白質(zhì)等生物大分子變性，有時(shí)甚至只能使待分離的生物大分子變性才能夠洗脫下來，使用特異性洗脫則可以避免這種情況。由于親和吸附達(dá)到平衡比較慢，所以特異性洗脫往往需要較常的時(shí)間和較大的洗脫條件，可以通過適當(dāng)?shù)母淖兤渌鼦l件，如選擇親和力強(qiáng)的物質(zhì)洗脫、加大洗脫液濃度等等，來縮小洗脫時(shí)間和洗脫體積。

? ⑵ 非特異性洗脫

非特異性洗脫是指通過改變洗脫緩沖液pH、離子強(qiáng)度、溫度等條件，降低待分離物質(zhì)與配體的親和力而將待分離物質(zhì)洗脫下來。

當(dāng)待分離物質(zhì)與配體親和力較小時(shí)，一般通過連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗，就可以在雜質(zhì)之后將待分離物質(zhì)洗脫下來，這種洗脫方式簡(jiǎn)單、條件溫和，不會(huì)影響待分離物質(zhì)的活性。但洗脫體積一般比較大，得到的待分離物質(zhì)濃度較低。當(dāng)待分離物質(zhì)和配體結(jié)合較強(qiáng)時(shí)，可以通過選擇適當(dāng)?shù)膒H、離子強(qiáng)度等條件降低待分離物質(zhì)與配體的親和力，具體的條件需要在實(shí)驗(yàn)中摸索。可以選擇梯度洗脫方式，這樣可能將親和力不同的物質(zhì)分開。如果希望得到較高濃度的待分離物質(zhì)，可以選擇酸性或堿性洗脫液，或較高的離子強(qiáng)度一次快速洗脫，這樣在較小的洗脫體積內(nèi)就能將待分離物質(zhì)洗脫出來。但選擇洗脫液的pH、離子強(qiáng)度時(shí)應(yīng)注意盡量不影響待分離物質(zhì)的活性，而且洗脫后應(yīng)注意中和酸堿，透析去除離子，以免待分離物質(zhì)喪失活性。對(duì)于待分離物質(zhì)與配體結(jié)合非常牢固時(shí)，可以使用較強(qiáng)的酸、堿或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑使蛋白質(zhì)等待分離物質(zhì)變性，而從配體上解離出來。然后再通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ勾蛛x物質(zhì)恢復(fù)活性。