1. 7種小兒腦癌組織學類型共218個腫瘤樣本蛋白質基因組學表征

2. 蛋白質組學揭示了不同組織學類型小兒腦癌的生物學特征

3. 蛋白質組學揭示了轉錄組學中不明顯的DNA改變的下游效應

4. 激酶活性分析為通路活性和藥物靶標提供見解

【流行病學】：小兒腦腫瘤是小兒癌癥死亡主要原因。根據(jù)美國腦腫瘤登記中心（CBTRUS）的統(tǒng)計，在2012年至2016年期間，美國14歲以下小兒中，惡性中樞神經系統(tǒng)的發(fā)病率為5.74/10萬，已經超過了小兒白血病的發(fā)病率，成為美國當時發(fā)病率最高，也是致死率最高的小兒癌癥。在亞洲地區(qū)，日本的發(fā)病率估計為3.61/10萬，中國臺灣省的發(fā)病率為1.7/10萬。

【診斷分類】：目前，小兒腦腫瘤的分類主要依照2007年及2016年世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類，其中，2007年WHO分類主要以組織學特征為依據(jù)，2016年又增加了分子特征為分型依據(jù)。常見的小兒腦腫瘤分類包括：膠質瘤、胚胎性腫瘤、生殖細胞腫瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤等。誘發(fā)原因包括電離輻射、遺傳因素、病毒、化學物質等。診斷手段主要通過神經影像學檢查，如磁共振成像（MRI）、CT來確定病變，通過組織學檢查確定腫瘤類型。治療手段以手術切除為主，放射、化學治療為輔的綜合治療。

【主要驅動基因】：IDH1，BRAFV600E，CTNNB1

【主要樣本】：低級別神經膠質瘤（LGG），室管膜瘤（EP），高級別神經膠質瘤（HGG），髓母細胞瘤（MB），神經節(jié)神經膠質瘤，顱咽管瘤（CP）和非典型畸胎樣橫紋肌瘤（ATRT）

【樣本狀態(tài)】：新鮮冰凍

【樣本數(shù)量】：218份

【主要研究路線與內容】：

1. 單組學分析：

組別： 不同癌組

WES：基因拷貝數(shù)、基因突變；

TMT蛋白組 & MRM靶向蛋白組：蛋白鑒定與定量數(shù)量；蛋白組與mRNA相關性分析

TMT磷酸化蛋白組：修飾蛋白、修飾肽段鑒定與定量數(shù)量

2. 整合分析：

一、多種學檢測結果的統(tǒng)計：

二、蛋白基因組分析與分子分型

1. 通過基于蛋白質組學數(shù)據(jù)的共識聚類分析，將小兒腦腫瘤分為8個亞型，分別為：Ependy（C1）, Medullo（C2）, Aggressive（C3）, Cranio/LGG-BRAFV600E（C4）, HGG-rich（C5）, Ganglio-rich（C6）, LGG BRAFWT-rich（C7）, and LGG BRAFFusion-rich（C8）。（1）這些亞型具有不同的生存結果、干性得分、增殖指數(shù)和信號通路活性；（2）多數(shù)分子亞型表現(xiàn)為組織類型的混合型；（3）基于蛋白質組和磷酸化數(shù)據(jù)可將顱咽管瘤（CP）分為兩個亞群，轉錄組水平無此能力；（4）尸檢樣本的磷酸化修飾具有異常表現(xiàn)，不適合與活檢樣本進行蛋白修飾水平的整合分析。

2. 亞型的分子活性特征：相比于LGG BRAFFusion-rich（C8）樣本，Cranio/LGG-BRAFV600E（C4）表現(xiàn)出較高的MEK/ERK及AKT/mTOR相關激酶通路的活性。說明某些顱咽管瘤（CP）病人可能從MEK-mTOR聯(lián)合抑制療法中獲益：

3. 為了驗證上述結果：該研究進一步利用基于質譜的MRM靶向方法，對 MEK/ERK途徑中的關鍵蛋白的表達情況進行了驗證。證實了C4和C8亞型在MEK/ERK/AKT激酶通路的差異。同時也表明：MRM分析技術，具有腫瘤分型方面的臨床應用可行性。

三、免疫浸潤分析

1. 基于轉錄組數(shù)據(jù)的腫瘤微環(huán)境細胞豐度分析，確定了5組具有不同免疫和間質特征的腫瘤類型：Cold-medullo, Cold-mixed, Neuronal, Epithelial和Hot型。

2. 與蛋白質組分型結果比較：侵襲性越強的腫瘤在蛋白質亞型具有更低的免疫浸潤性，如Aggressive, Medullo和Ependy型。而LGG BRAFWT-rich, LGG BRAFFusion-rich, 和Cranio/LGG BRAFV600E免疫浸潤更高。

3. Hot型：屬于LGG, HGG和ganglioglioma組織混合類。其包含多種類型的免疫細胞，包括巨噬細胞、小膠質細胞和樹突狀細胞。與其他腫瘤相比，Hot型顯示出包括上皮-間質轉化（EMT）等相關免疫途徑上調表達。此外，具有免疫抑制功能的腺苷的相關代謝，在此類亞型中上調，提示腺苷抑制類藥物值得進一步探索。

4. Neuronal型：同樣是LGG, HGG和ganglioglioma的混合組織型。其特征為谷氨酸受體通路、神經遞質轉運通路及細胞生長的激活。Neuronal型也表現(xiàn)出能量代謝途徑的上調，如氧化磷酸化、線粒體蛋白復合物和糖酵解。提示如將谷氨酰胺拮抗劑作為“代謝免疫檢查點”進行免疫治療，這類亞型的病人可能獲益。

5. Epithelial型：僅對應起源于上皮的CP瘤。其特征為EMT及CTLA4、PD-1分子表達上調。因此該亞型可從免疫檢查點治療獲益，與之前報道一致。

6. Cold-medullo與Cold-mixed型：其特征為WNT信號，?-catenin TCF complex裝配, apoptosis和proteasome上調。該特征僅在蛋白與磷酸化水平呈現(xiàn)。

7. BRAF基因融合及突變與免疫特征：BRAFFusion和BRAFV600E是LGG腫瘤重要致癌驅動因素，與多種免疫特征密切相關。值得注意的是，與野生型相比，BRAFFusion和BRAFV600E腫瘤中的APM I類基因上調表達，BRAFFusion中M1巨噬細胞和M2小膠質細胞上調表達。BRAFFusion促進更多M2小膠質細胞，而BRAFV600E促進更多M2巨噬細胞。

四、整合蛋白質基因組學揭示體細胞突變和拷貝數(shù)變異（CNV）對功能分子表達的影響

1. 體細胞突變對RNA/蛋白質水平的影響：（1）BRAF：與野生型 LGG腫瘤相比，具有BRAFV600E突變的LGG腫瘤，BRAF蛋白豐度顯著下調。（2）CTNNB1：突變導致CP樣本中蛋白質/RNA水平升高；（3）NF1：突變導致HGG中蛋白和轉錄本下調表達。

2. 基因拷貝數(shù)在不同組織類別中，具有不同的cis調控效應：MB、HGG和EP腫瘤均顯示出相對較高的基因組不穩(wěn)定性。在這三種腫瘤中均觀察到RABGAP1L，RAB3GAP2和FDPS的反復擴增，但僅在EP中觀察到RABGAP1L擴增對其蛋白/磷酸蛋白顯著影響；而FDPS的CNV / RNA /蛋白級聯(lián)變化僅發(fā)生在HGG中。

3. 體細胞突變與CNV的trans調節(jié)：編碼β-catenin的CTNNB1突變是CP樣本中最主要的trans調控基因。CTNNB1突變與細胞間粘附相關的蛋白質/磷酸化以及WNT信號通路成員（如APC、GSK3A和GSK3B）上調表達有關。

五、基于磷酸化蛋白質組學的激酶活性分析

1. CDK1\CKD2：是參與細胞周期調控的蛋白依賴性激酶。其在ATRT、MB、HGG和EP等增殖性更強的腫瘤中活性增強。

2. CaMK2A：在HGG中，CaMK2A具有較高的蛋白表達和激酶活性；激酶-底物網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)CaMK2A與連接蛋白43（GJA1）與SYN的第568位和605位絲氨酸相關。說明CaMK2A可能在膠質瘤侵襲中有重要作用。

3. 從蛋白表達豐度的反向關系來看，CDK1/2和CaMK2A可能是兩條獨立的信號機制。

4. CDK5/GSK3B：CDK5/GSK3B在LGG中的Ganglio-rich亞型中上調。激酶-底物網(wǎng)絡分析顯示，CDK5/GSK3B與ADD2、SYN1、STMN1的磷酸化相關。這些結果與神經膠質瘤可通過創(chuàng)建神經元-神經膠質瘤突觸，來劫持神經元發(fā)育的發(fā)現(xiàn)一致。

六、蛋白基因組解析低級別神經膠質瘤（LGG）的關鍵分子BRAF及藥靶發(fā)現(xiàn)

BRAF是重要治療靶點。對BRAF突變及基因融合的解析發(fā)現(xiàn)：與BRAFWT腫瘤相比，BRAFV600E和BRAFFusion腫瘤顯示出常見的、改變類型特異性變化。

1. BRAFV600E腫瘤中：絲裂原激活的蛋白激酶信號通路(MAPK; ERK)的蛋白豐度發(fā)生顯著改變。

2. BRAFV600E腫瘤中：AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT1和AKT2的RNA /蛋白豐度，以及AKT1S1的RNA明顯上調表達

3.? BRAF的磷酸化共表達網(wǎng)絡：共表達網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)2個在BRAFV600E和BRAFFusion顯示中顯著上調的模塊。模塊1顯著富集于MYC靶點和G2M檢驗點相關磷酸化位點。同時，模塊1中顯著富集的磷酸化位點受AKT2調控。

七、蛋白基因組解析高級別神經膠質瘤（HGG）的潛在預后標志物及藥靶

1. 異檸檬酸脫氫酶（IDHs）與預后：IDHs被認為是astrocytomas, oligodendrogliomas及secondary glioblastomas的潛在膠質瘤治療靶點，但在HGG中具有較低頻的突變。另外，最近有研究指出IDHs可能在成年人群的黑色素瘤、膠質瘤和腎癌中具有診療意義，因此值得進一步關注。

（1）在H3WT情況下：IDH全蛋白的表達均和患者總生存期（OS）改善正相關。雖然IDH全蛋白與OS改善有關，但IDH1與IDH2/3的表達無相關性，因而可能存在聯(lián)合診斷的價值。聯(lián)合IDH1和IDH2蛋白，通過建立多變量Cox回歸模型分析顯示，在H3WT HGG患者中，當IDH1和IDH2的總豐度降低50％時，死亡風險增加23.58倍。通過對41個小兒HGG樣本TMT蛋白質組學分析，確認了聯(lián)合IDH1/2蛋白豐度表達降低與更短的OS相關。

（2）在H3Mut情況下：與H3wt不同，IDH1/2 蛋白與OS改善呈現(xiàn)反相相關性，需要進一步更大隊列驗證。

2. 尋找HGG的潛在藥靶：基于蛋白基因組及藥物關聯(lián)性分析，我們可找出可干預HGG特征的關鍵生物過程，但對蛋白與轉錄層面作用相反的潛在藥靶。由于該研究沒有癌旁組織作為對照，因此以LGG作為對照組。

（1）CDK抑制劑被預測可以同時從轉錄及磷酸化水平逆轉HGG的進程，CDK1和CDK2的激酶活性顯著上調。

（2）MEK, proteasome和HDAC 的抑制劑僅作用于轉錄層面。其中，盡管在磷酸蛋白質組學中未觀察到MEK底物，但MEK下游的MAPK1激酶活性上調。

八、原發(fā)性和復發(fā)性小兒腦瘤的比較分析

曾有報道發(fā)現(xiàn)同一病人的原發(fā)及復發(fā)腫瘤具有不同的表達模式。作者利用本研究中的18對樣本的基因組和蛋白組數(shù)據(jù)，希望進一步回答：在治療評估期，是否應將復發(fā)性腫瘤進行單獨考慮：

1. 基因突變：復發(fā)組織具有0%–52% (平均18%) 的原發(fā)組織突變。值得注意的是，所有髓母細胞瘤（MB）進展期的樣本都具有TP53突變，但在其原發(fā)組織中并未有此突變；此外，復發(fā)樣本中的染色體臂畸變增加，斷點數(shù)平均從32個增加到53個。

2. 蛋白質組：

（1）原發(fā)性和復發(fā)性腫瘤具有不同的蛋白質組模式，它們被歸類為不同的蛋白質組亞型。

（2）原發(fā)性和復發(fā)性腫瘤在蛋白質組學水平的相關性并不高。

（3）原發(fā)性和復發(fā)性腫瘤具有不同的信號通路激活變化，因此藥物治療響應也可能有所不同。

該研究對7種不同組學類型（包括低級別神經膠質瘤（LGG），室管膜瘤（EP），高級別神經膠質瘤（HGG），髓母細胞瘤（MB），神經節(jié)神經膠質瘤，顱咽管瘤（CP）和非典型畸胎樣橫紋肌瘤（ATRT））共218份小兒腦腫瘤樣本進行全基因組、轉錄組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組學表征，通過對蛋白質組學數(shù)據(jù)共識聚類分析，將小兒腦腫瘤分為8種亞型，它們具有不同的生存結果、干細胞分數(shù)、增殖指數(shù)和信號通路活性。免疫特征分析揭示了診斷過程中多種多樣的腫瘤微環(huán)境。蛋白質組學數(shù)據(jù)還進一步揭示了在轉錄組學數(shù)據(jù)中不明顯的體細胞突變和拷貝數(shù)變異的功能效應。激酶-底物關聯(lián)和共表達網(wǎng)絡分析揭示了重要的腫瘤發(fā)生的生物學機制。該研究是小兒腦腫瘤首個大規(guī)模的蛋白質基因組學分析，為揭示小兒腦腫瘤生物學特征以及為選擇合理的治療方案提供理論依據(jù)。