癌癥是一種涉及遺傳變異和表觀遺傳改變的復(fù)雜疾病，在其發(fā)生發(fā)展過程中獲得了一系列的代表特征，包括：持續(xù)的增殖信號，逃避生長抑制調(diào)控，抗細(xì)胞凋亡，永久復(fù)制能力，新生血管增生，侵襲和轉(zhuǎn)移的激活，能量代謝重編程，規(guī)避免疫破壞和炎癥的產(chǎn)生等。這些表型的遺傳基礎(chǔ)在于其基因組的不穩(wěn)定性，這導(dǎo)致腫瘤的遺傳多樣性，進(jìn)而呈現(xiàn)出上述代表性特征。除了遺傳基礎(chǔ)外，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展還與表觀遺傳密切相關(guān)。DNA甲基化修飾是表觀遺傳的重要范疇，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑，染色體穩(wěn)定性維持，干細(xì)胞維持和自我更新，胚胎發(fā)育分化，個體的衰老和發(fā)育異常及疾?。ㄈ缒[瘤、糖尿病、精神病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等復(fù)雜疾病）的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。表觀遺傳學(xué)在疾病中的研究已越來越得到業(yè)界的廣泛認(rèn)同，成為當(dāng)今生命科學(xué)的一個重要的前沿和熱點領(lǐng)域。

以DNA甲基化修飾為代表的表觀遺傳既具備遺傳的穩(wěn)定性，又能夠適時應(yīng)對發(fā)育進(jìn)化、環(huán)境改變以及免疫入侵等變化。人體中一套特定的染色體發(fā)展成200多種細(xì)胞，又能夠?qū)崟r的適應(yīng)環(huán)境變量，表觀遺傳的作用功不可沒。例如在免疫方面，造血母細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生各種不同功能淋巴細(xì)胞的各種中，就受到DNA甲基化的調(diào)控。

我們建議對利用甲基化結(jié)合多組學(xué)的策略研究腫瘤這種涉及遺傳變異和表觀遺傳改變的復(fù)雜疾病，以更全面準(zhǔn)確地對其分型及深入研究其機制。同時我們建議立足于腫瘤基因組及表觀基因組的不穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，從免疫、炎癥、增殖、轉(zhuǎn)移、微環(huán)境、能量代謝重編程等新角度進(jìn)一步分析腫瘤的致病機制。

服務(wù)推薦：中科普瑞 Illumina?Infinium MethylationEPIC BeadChip服務(wù)（簡稱850K芯片）

甲基化芯片研究案例：

1、甲基化在細(xì)胞分化與腫瘤形成中的機制研究 - - 以正常B細(xì)胞為參照分析套細(xì)胞淋巴瘤的DNA甲基化譜

原文標(biāo)題： Decoding the DNA Methylome of Mantle Cell Lymphoma in the Light of the Entire B Cell Lineage.?????? PMID:27846393

腫瘤是一種發(fā)病機制復(fù)雜，個體差異很大的疾病，其基因組、轉(zhuǎn)錄組和甲基化修飾都會發(fā)生大量的變異，此外腫瘤的異質(zhì)性更會對其研究增加難度。腫瘤研究的前沿將會向著單細(xì)胞的方向，排除腫瘤異質(zhì)性的影響，更深入與細(xì)致地研究遺傳或表觀遺傳在腫瘤發(fā)生過程中的調(diào)控機制。

以下對套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphomas，MCL) 甲基化修飾研究以分析其發(fā)生機制的案例，將給我們一個解決腫瘤異質(zhì)性問題的提示。MCL是一種非霍奇金淋巴瘤，作為其正常對照的B淋巴細(xì)胞，本身就有著復(fù)雜的表觀遺傳背景，在成熟過程中的甲基化修飾發(fā)生了復(fù)雜的改變。本文在對82例套細(xì)胞淋巴瘤(MCL) 的DNA甲基化譜分析中, 不但考慮到了腫瘤本身的異質(zhì)性，同時也以B 細(xì)胞成熟過程中各細(xì)胞亞群的甲基化譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。該研究發(fā)現(xiàn)：MCL可通過甲基化譜分為兩個亞群, 分別攜帶了生發(fā)中心（germinal center）和非生發(fā)中心的B細(xì)胞的甲基化印記； MCL淋巴瘤發(fā)生期間的甲基化譜在很大程度上受其來源的正常 B 細(xì)胞的甲基化動態(tài)的影響；遠(yuǎn)端的增強子元件的表觀變異也可能是腫瘤的驅(qū)動原因；MCL的甲基化個體間差異很大，且甲基化變異的程度可以作為預(yù)后的指導(dǎo)[4]。?

在腫瘤的研究中，會遇到腫瘤的異質(zhì)性以及腫瘤細(xì)胞中混有其他正常細(xì)胞成份的情況，本研究中所得到的樣本中MCL的比例從56%~100%不等，這為其研究帶來了很大的偏差。研究者借鑒了EWAS中計算血細(xì)胞成分的算法，從分析上在結(jié)果中去除了非MCL的成份，“純化”了MCL細(xì)胞，得到可靠的甲基化數(shù)據(jù)。

經(jīng)分析，MCL可分為兩大個亞群，通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，MCL與B細(xì)胞發(fā)育中的后期樣本，在主成分1中更接近，而其中一個亞群（藍(lán)色點）與其來源的B細(xì)胞較接近。以下PCA圖與熱圖可直觀的看到不同的MCL亞群以及B細(xì)胞發(fā)育過程中各階段的樣本的相互關(guān)系，及其甲基化情況。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MCL與其來源的B細(xì)胞特定發(fā)育階段的樣本，在甲基化修飾上具有相似性。但在MCL中每個樣本變異的甲基化位點多，且個體差異很大，找不到很一致的變異。

作者注意到中進(jìn)一步參考TMB，分析了甲基化變異負(fù)荷與預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)高甲基化變異的樣本，預(yù)后更差；同時也注意到，在C1亞群中，攜帶更多常見MCL突變的樣本，更易出現(xiàn)較多的甲基化變異。

最后，根據(jù)以上結(jié)果提出了MCL發(fā)生的（表觀）遺傳機制，MCL的發(fā)生既與其遺傳變異相關(guān)，也與B細(xì)胞在發(fā)育過程的階段相關(guān)，在生發(fā)中心進(jìn)一步變異的B細(xì)胞形成了C1亞群的MCL，其后發(fā)育階段的B細(xì)胞變異形成了C2亞群的MCL。

2、甲基化分析揭示幼年型粒-單核細(xì)胞白血病中的不同亞型

原文標(biāo)題： RAS-pathway mutation patterns define epigenetic subclasses in juvenile myelomonocytic leukemia. PMID:29259247

JMML是一種罕見的侵襲性骨髓增殖性疾病，有約50%是由KRAS，NRAS或PTPN11基因突變引起。目前對于 JMML 中的RAS通路的突變，與其生物學(xué)上的異質(zhì)性和臨床結(jié)果的關(guān)系尚不清楚。本研究通過對JMML的DNA 甲基化的研究，發(fā)現(xiàn)可通過甲基化標(biāo)記將JMML分為三個亞組（甲基化水平高、中、低）。甲基化水平高的病人，預(yù)后較差；甲基化水平低的病人，預(yù)后良好。

本文在分析中先分析了多功能造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells, HSC）與六種常見的血細(xì)胞（granulocytes, monocytes, NK cells, CD8+ T-cells, CD4+ T-cells, and B-cells）間的差異甲基化位點 ，這些位點是正常血細(xì)胞發(fā)育分化過程中變化的位點，在后續(xù)對JMML的分析中將被過濾掉。進(jìn)一步找到JMML中變異的甲基化位點，以此作為對JMML的亞型區(qū)分的標(biāo)記[5]。

進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，利用找到的差異甲基化位點可將JMML區(qū)分為三個亞組，其中高甲基化的亞組的JMML病人預(yù)后較差，低甲基化的病人預(yù)后最好。

作者進(jìn)一步分析了突變與甲基化譜之間的相關(guān)性，不過并沒有找到的顯著的關(guān)聯(lián)，不過發(fā)現(xiàn)JMML特異的甲基化位點與PRC復(fù)合物以及RAS的靶基因相關(guān)。

3、對上千例腦膠質(zhì)瘤的多組學(xué)Meta分析得到更精細(xì)而可靠的分型

原文標(biāo)題： Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. PMID:28966033

腫瘤是一種復(fù)雜的疾病，涉及基因組、表觀基因組的變異，以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組的變化，在經(jīng)費允許的情況下，通過多組學(xué)的分析能夠更全面地了解其發(fā)生機制，并得到更可靠的分型結(jié)果。

本案例通過對超過1000例的小兒惡性膠質(zhì)瘤（Pediatric glioblastoma,pGBM）和彌漫性腦橋膠質(zhì)瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG)病人的基因組和表觀基因組的Meta分析，主要關(guān)注于組蛋白突變，甲基化與CNV等方面。確定了組蛋白突變子群中的一些突變，如H3.3G34R/V 中的 FBXW7缺失、H3.3K27M 中的TOP3A 重排和 H3.1K27M 中的 BCOR 突變；通過基因組的關(guān)鍵變異和甲基化譜能夠?qū)Φ图墑e腫瘤更細(xì)致地描繪。此外，由于基因變異隨著年齡增長而積累, 揭示對于嬰兒患者在生物學(xué)和臨床治療上的區(qū)別；對于小群體中出現(xiàn)的罕見通路紊亂，進(jìn)一步確定了此疾病在分子層面的復(fù)雜性, 為其生物學(xué)研究開辟了新的途徑, 并為其未來的治療分層提供了功能界定基礎(chǔ)[6]。

首先對pGBM和DIPG的臨床病理學(xué)以及在組蛋白編碼基因變異、DNA甲基化修飾譜改變的水平上進(jìn)行比較分析，同時比較不同的分型以及整合的分型結(jié)果對于預(yù)后上差異。?

此外還分析了CNV對于疾病分型的效果，并綜合分析了發(fā)病部位、組蛋白變異、甲基化修飾的情況。進(jìn)一步定位到了一些關(guān)鍵基因的CNV變異和重排，并進(jìn)行了細(xì)致的展示。?

最后，對一些關(guān)鍵基因的突變和CNV變異進(jìn)行了匯總和展示 ；并結(jié)合關(guān)鍵的病理分型、組蛋白、甲基化和CNV等層面進(jìn)行了整合分析；通過對整合的分子通路分析，發(fā)現(xiàn)此疾病個體差異很大，可能涉及到多種通路，為其治療提出了新的指導(dǎo)。?

可見，整合的多組學(xué)分析，能夠在不同的分子層面上對腫瘤這類復(fù)雜的疾病進(jìn)行全面的分析，提供更準(zhǔn)確而細(xì)致的分型結(jié)果，是我們更準(zhǔn)確的認(rèn)識癌癥以及精準(zhǔn)醫(yī)療的提供了有效的手段，這將是未來對于癌癥研究的方向與趨勢。

4、甲基化分子標(biāo)記對于腫瘤診斷與預(yù)后的應(yīng)用--對于多種常見腫瘤的診斷與預(yù)后

原文標(biāo)題： DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers. PMID:28652331

眾所周知，在腫瘤發(fā)生的早期就已經(jīng)出現(xiàn)了基因的異常甲基化修飾，而且胞嘧啶的甲基化修飾也是一種在血漿中穩(wěn)定存在并可精確檢測的，同時DNA的甲基化修飾還攜帶了其來源的組織的特征譜。所以甲基化修飾是一種極具潛在價值的腫瘤早期診斷分子標(biāo)記，不過之前由于檢測技術(shù)上的不穩(wěn)定，以及樣本的個體間差異，在缺少大量數(shù)據(jù)支持的情況下，甲基化分子標(biāo)記一直沒有得到廣泛應(yīng)用。不過得益于Infinium芯片技術(shù)的應(yīng)用和數(shù)據(jù)的積累，我們可以對大量的穩(wěn)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合全面的分析，進(jìn)行分子標(biāo)記研究與開發(fā)工作。

本案例通過對三個腫瘤數(shù)據(jù)庫中約2800個腫瘤樣本（直腸癌、肺癌、乳腺癌和肝癌）和約590個對應(yīng)正常組織的DNA甲基化水平進(jìn)行分析，比較了不同組織來源的DNA甲基化修飾譜，以及腫瘤的甲基化特征譜。發(fā)現(xiàn)通過甲基化分子標(biāo)記可以有效區(qū)分結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌和肝癌四種常見惡性腫瘤，其中對正常組織和腫瘤組織區(qū)分的準(zhǔn)確率基本上超過95%。此外利用甲基化分子標(biāo)記還能夠從轉(zhuǎn)移灶中正確的識別癌細(xì)胞的原發(fā)來源，例如結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病灶和肺轉(zhuǎn)移病灶可達(dá)到97%和94%的識別準(zhǔn)確率[7]。

此外，利用特定位點DNA甲基化分子標(biāo)記組合，也可以對多種腫瘤的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，取得了較好的效果。

雖然在文章中所用到的分子標(biāo)記數(shù)目較多，在實際應(yīng)用層面還有需要進(jìn)一步減少位點數(shù)，但此方法也為腫瘤的早期診斷及預(yù)后提供了很好的借鑒。

5、甲基化分子標(biāo)記對于腫瘤診斷與預(yù)后的應(yīng)用--ctDNA甲基化標(biāo)記對肝癌的診斷及預(yù)后

原文標(biāo)題： Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. PMID: 29035356

在之前的案例中介紹了利用甲基化分子標(biāo)記進(jìn)行多種常見腫瘤的診斷及預(yù)后的應(yīng)用研究，以下案例是在之前研究的基礎(chǔ)上，針對肝癌進(jìn)行了大規(guī)模的臨床數(shù)據(jù)分析和深度機器學(xué)習(xí)得到了用于肝癌早期篩查、風(fēng)險評估和預(yù)后監(jiān)測的甲基化模型[8]。

先從1000有差異的候選標(biāo)記中利用分子掛鎖技術(shù)（padlock）進(jìn)行篩選，得到了401個可用的標(biāo)記，進(jìn)一步在大量樣本中進(jìn)行診斷與預(yù)后的機器學(xué)習(xí)尋找檢測標(biāo)記panel和驗證，最后得到了10個CpG位點的診斷甲基化標(biāo)記組合，以及8個位點的預(yù)后標(biāo)記組合，詳見下圖。

下圖展示了10個診斷甲基化標(biāo)記的列表，及其在訓(xùn)練集與驗證集中的靈敏度、特異性、ROC曲線及熱圖。通過10個甲基化分子標(biāo)記建立了肝癌的綜合診斷模型cd-score。其中在訓(xùn)練集的靈敏度為87.5%, 特異性為94.3%；在驗證集中的靈敏度為83.3%, 特異性為90.5%。cd-score可以用于肝癌與肝臟類疾病的鑒別診斷，還可以根據(jù)分期、治療與否、手術(shù)是否殘留和肝癌復(fù)發(fā)等腫瘤負(fù)荷情況與甲基化水平的關(guān)聯(lián)用于腫瘤療效預(yù)測和監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)。

6、甲基化分子標(biāo)記對于腫瘤PD-1免疫治療預(yù)后的應(yīng)用

原文標(biāo)題： Epigenetic prediction of response to anti-PD-1 treatment in non-small-cell lung cancer; a multicentre, retrospective analysis. PMID: 30100403

PD-1是在活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞中表達(dá)的免疫檢查點受體，其通過與癌細(xì)胞上的PD-L1配體結(jié)合，抑制T細(xì)胞活化，導(dǎo)致免疫抑制。抗PD-1治療晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）提高了患者的生存期，是目前倍受關(guān)注的免疫療法。然而，相當(dāng)大比例的患者對此治療沒有反應(yīng)，所以對其用藥指導(dǎo)的分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用是當(dāng)前研究熱點。目前對于檢查點抑制劑最熱門的分子標(biāo)記是腫瘤突變負(fù)荷（TMB），而本文研究了DNA甲基化譜用于預(yù)測抗PD-1抑制劑-- nivolumab或pembrolizumab治療患者對當(dāng)前IV期NSCLC患者療效的應(yīng)用，并取得了良好的效果。

這是一項多中心研究，從法國、西班牙和意大利的15家醫(yī)院招募成年患者81名（發(fā)現(xiàn)集34名及驗證集47名）利用850K芯片分析其全基因組甲基化譜。這些患者經(jīng)組織學(xué)證實為IV期NSCLC，并在疾病過程中曾接受過PD-1阻斷治療。在發(fā)現(xiàn)集中（應(yīng)答者10名及無應(yīng)答者24名）得到了301個CpG位點的組合(EPIMMUNE表觀遺傳特征)，這組標(biāo)記與無進(jìn)展生存期和總生存期的預(yù)后顯著相關(guān)（圖1）。

其后，在驗證集的47名患者（應(yīng)答者14名，無應(yīng)答者33名）， 證明此EPIMMUNE表觀遺傳特征，仍與無進(jìn)展生存期顯著相關(guān)（圖2）。

其后又利用TCGA的公共數(shù)據(jù)對這些標(biāo)記進(jìn)行了驗證，確認(rèn)其只與用藥有關(guān)，而非本身就與預(yù)后相關(guān)。由于TCGA的數(shù)據(jù)來源是450K芯片，所以只能取兩套芯片探針數(shù)據(jù)的交集（146個，EPIMMUNE-TCGA）進(jìn)行驗證。首先證明EPIMMUNE-TCGA標(biāo)簽在自己的數(shù)據(jù)集中仍然與用藥的預(yù)后相關(guān)（圖3A），并在TCGA數(shù)據(jù)集中確認(rèn)這些標(biāo)記與預(yù)后無關(guān)（圖3B）。

其后又進(jìn)行了放大樣本的驗證，用焦磷酸測序方法評價單個基因的甲基化預(yù)測效果，發(fā)現(xiàn)了FOXP1基因的甲基化情況也與抗PD-1治療后無進(jìn)展生存率有關(guān)。

目前對PD-1抑制劑提出了多種生物標(biāo)志物，包括：PD-1蛋白的表達(dá)，RNA轉(zhuǎn)錄譜，腫瘤突變負(fù)荷，腫瘤內(nèi)細(xì)胞類型組成等。而此項研究突破性地證明了DNA甲基化譜在此方面也具備很好的預(yù)后效果，為腫瘤免疫療法的分子標(biāo)記開創(chuàng)了新的研究方向。