表觀遺傳學中DNA和蛋白的互作是基因轉錄調控的關鍵，亦是基因轉錄啟動的前提，不少科研項目都以其為切入點。DNA和蛋白互作技術有很多，比如染色質免疫共沉淀技術（ChIP）、CUT&Tag、DNA親和純化測序（DAP-seq）、凝膠遷移阻滯(EMSA)、酵母雜交系統(tǒng)和熒光素酶報告基因等。

ChIP-seq、CUT&Tag和DAP-seq“三劍客”是與高通量測序結合的技術，可在全基因組范圍內研究DNA與蛋白互作，是很多課題的首選。今天，我們和大家聊聊這三種技術的差異，以及DNA蛋白互作組學的研究思路。

一、技術簡介

很多小伙伴對于ChIP-seq、CUT&Tag和DAP-seq如何選擇比較糾結？結合技術特點，我們談談它們的差異點以及如何選擇。

ChIP-seq歷史最悠久，技術比較成熟穩(wěn)定。它首先利用染色質免疫共沉淀技術特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構建；然后對富集到的DNA片段進行高通量測序。最后，利用生信分析在全基因組范圍內獲取與轉錄因子、組蛋白等互作的DNA區(qū)段信息。

CUT&Tag和DAP-seq技術是近幾年發(fā)展起來的新技術。CUT&Tag通過蛋白特異性抗體引導Protein A-Tn5酶在目標蛋白結合的DNA位置進行切割并且在序列兩端加上測序接頭，經(jīng)過PCR擴增后形成可用于高通量測序的文庫，隨后對文庫進行測序分析從而解析與目標蛋白結合的 DNA片段。

CUT&Tag技術不需要超聲打斷，也不需要傳統(tǒng)的連接法添加測序接頭，具有操作簡便、周期短、信噪比高、重復性好、低細胞起始量等優(yōu)勢。但CUT&Tag比較適合組蛋白修飾的研究，部分轉錄因子有較好的實驗數(shù)據(jù)。

目前CUT&Tag在轉錄因子的應用上有一定的局限性。ChIP-seq和CUT&Tag實驗過程中都需要使用到抗體，首推商業(yè)化ChIP級別抗體/標簽抗體。但許多項目存在無商業(yè)化抗體、目的蛋白低表達或染色質提取困難等問題，尤其是植物樣本，那這種情況就可以考慮DAP-seq技術。

DAP-seq技術于2016年發(fā)表在Cell期刊，它是將蛋白質體外表達與高通量測序技術結合，使用體外表達的TF蛋白對裸露的全基因組DNA片段進行孵育，以確定結合序列。

主要步驟如下：

1. 文庫構建：提取基因組DNA，進行基因組DNA文庫構建；

2. 體外表達蛋白：利用HaloTag載體，將目的蛋白與HaloTag融合表達；

3. 親和純化：將純化的融合蛋白與基因組文庫孵育。然后，通過HaloTag特異性磁珠，將目的蛋白和DNA復合物進行提取與純化，隨后捕獲的DNA片段進行擴增，測序分析，探究目的蛋白結合的DNA片段。

DAP-seq技術是真核體外無細胞蛋白表達系統(tǒng)，主要為使用獨特的技術去除了翻譯抑制物的麥胚提取物，能夠大量表達可溶性的全長蛋白。所以，該技術在植物樣本研究轉錄因子與DNA互作的方向有天然的優(yōu)勢。

◆??小 結：

? ChIP-seq：需要ChIP-seq級別抗體，對樣本量要求高，適用于組蛋白修飾和轉錄因子;

??CUT-Tag：需要ChIP-seq級別抗體，對樣本量要求低，更適用于組蛋白修飾;

??DAP-seq：無需抗體，采用無細胞植物麥胚表達系統(tǒng)，對樣本量要求低，但適用于植物的轉錄因子。

二、研究思路

DNA蛋白互作組學的研究對象主要是轉錄因子和組蛋白，接下來，我們從這兩個方向談談研究思路，希望能給大家提供新的科研思路和靈感。ChIP技術成熟穩(wěn)定，適配的研究對象更多，所以舉例時以ChIP-seq為主。

01?轉錄因子

轉錄因子調節(jié)基因的表達，無論是醫(yī)學、動物還是植物領域都擁有重要的研究價值。

據(jù)報道，轉錄因子在癌癥、自身免疫、糖尿病和心血管疾病等疾病中具有關鍵的生物學作用，因此它被認為是極具潛力的治療靶點[2]。目前，轉錄因子小分子藥物開發(fā)是一個新興領域，前景不錯。利用DNA蛋白互作技術探究轉錄因子調控機制，有利于疾病的診斷和治療。

轉錄因子在植物體內普遍存在，參與環(huán)境應答反應。鑒于它在植物抗逆中的重要作用，很多項目以植物轉錄因子為研究對象，pubmed中植物轉錄因子的文章也在逐年增長中。

研究思路

·? 探究下游靶基因的思路? ·

01?確定研究的主題

有了研究主題，就能確定研究材料。醫(yī)學方向根據(jù)研究疾病類型選擇合適的材料，比如健康vs病人組織，預后組織，小鼠模型或者細胞系等；植物處理前后、不同部位、不同時期、突變體VS野生型等組織；動物與植物類似。微生物也分處理前后菌株，突變體VS野生型菌株。在選材時，可以參考文獻資料選擇時期和取樣部位等。

02?確定標記基因

大體上從兩個方面展開：第一，參考文獻中別的物種或組織中報道過功能的基因；第二，利用轉錄組測序尋找差異基因，篩選候選TF基因。

03 表達分析和功能驗證

在研究樣本中檢測目的基因（文獻或RNA-seq通常會提供多個候選基因）的mRNA和蛋白的表達情況。醫(yī)學方向，預后和臨床分析是比較常見手段。然后，對轉錄因子功能驗證。醫(yī)學方向通常選擇細胞系/小鼠模型驗證。植物和微生物，一般選擇構建突變體。、

04?尋找下游靶基因

ChIP-seq是利用染色質免疫共沉淀技術特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段。這些DNA片段建庫測序后，下機后得到的reads比對到參考基因，靶蛋白結合的DNA片段越多，那么會呈現(xiàn)reads顯著性堆疊的區(qū)域，這個區(qū)域是peak區(qū)域。對peak的分析，可以分析關聯(lián)基因以及motif。聯(lián)合RNA-seq數(shù)據(jù)判斷這些基因是否存在差異表達，從而推測靶基因。結合前期的功能實驗，進一步判斷基因的功能。

05?驗? 證

對ChIP-seq結果進行驗證，ChIP-qPCR、EMSA、酵母單雜等技術都是常用手段。證明轉錄因子確實與關鍵性的基因區(qū)域結合后，差不多一篇文章就到這里了。如果能進一步對發(fā)現(xiàn)的靶基因進行功能驗證，那么文章會再上一個檔次。

最后，通常會對結果進行推測，構建調控網(wǎng)絡或模型。

02 組蛋白

組蛋白修飾常常被認為是基因表達的分子開關，介導可逆、可遺傳調控，這種動態(tài)調控由相關酶進行控制，維持細胞穩(wěn)態(tài)。這種穩(wěn)態(tài)的打破在醫(yī)學上會影響疾病的發(fā)生和進展，在植物上會影響生長發(fā)育和逆境脅迫。

組蛋白修飾的研究思路是先確定修飾類型。通常根據(jù)western blotting結果或文獻資料，確定研究的物種/組織在組蛋白修飾水平上確實存在差異。

然后，收集樣本進行ChIP-seq。樣本選擇和轉錄因子類似，組蛋白修飾的抗體都是比較常用的商業(yè)化抗體，在抗體這一部分難度少很多。技術上，選擇ChIP-seq或CUT&Tag都可以。生信分析時聯(lián)合RNA-seq，尋找組蛋白修飾影響的基因。這部分思路通過peak關聯(lián)的基因尋找修飾水平和轉錄水平均下降的基因，進而挖掘調控基因/增強子。

最后，驗證。通常用到的技術有ChIP-qPCR（調控基因）和熒光素酶報告基因（增強子啟動子互作對）。功能驗證與轉錄因子類似，選擇細胞系、小鼠模型或突變體，然后對它們的表型或生理指標進行檢測，從而確定靶基因的功能。

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參考文獻：

【1】Pramanik D, Shelake RM, Kim MJ, Kim JY. CRISPR-Mediated Engineering across the Central?Dogma in Plant Biology for Basic Research and Crop Improvement. Molecular Plant. 2021. 14(1): 127-150.

【2】Lee TI and Young?RA. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 2013. 152: 1237-1251.