重組腺相關(guān)病毒（aAAVs，recombinant adeno-associated viruses）是一種通過(guò)靜脈給藥的高效基因運(yùn)輸載體，然而，天然血清型會(huì)表現(xiàn)出有限的趨向性集合，近日，一項(xiàng)刊登在國(guó)際雜志Nature Methods上題為“Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types”的研究報(bào)告中，來(lái)自加州理工學(xué)院等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們?yōu)榱藬U(kuò)展aAAVs的應(yīng)用，對(duì)AAV衣殼進(jìn)行了改進(jìn)使其能夠有效地轉(zhuǎn)換成年小鼠大腦中特殊的細(xì)胞類型，基于CREATE（Cre-recombination-based AAV targeted evolution，基于重組的AAV靶向進(jìn)化）平臺(tái)，研究人員開(kāi)發(fā)出了一種多路復(fù)用的CREATE平臺(tái)（M-CREATE），其能通過(guò)多種積極和消極的選擇標(biāo)準(zhǔn)來(lái)識(shí)別給定選擇場(chǎng)景中研究人員感興趣的突變體。

圖片來(lái)源：Sripriya Ravindra Kumar in the Gradinaru laboratory at the California Institute of Technology

研究者表示，M-CREATE能夠整合新一代的測(cè)序技術(shù)、合成文庫(kù)生成及專用的分析通路技術(shù)，從而幫助研究人員識(shí)別出能廣泛轉(zhuǎn)化中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衣殼突變體，這就能夠表現(xiàn)出對(duì)血管細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的偏愛(ài)，并以更高的特異性靶向作用神經(jīng)元細(xì)胞或者跨越多種鼠類的血腦屏障，總而言之，M-CREATE方法能夠加速研究人員尋找特殊衣殼來(lái)用作神經(jīng)科學(xué)和基因療法等應(yīng)用。

研究人員開(kāi)發(fā)出的這種新方法能夠快速有效地識(shí)別專門(mén)的AAV突變體，從而運(yùn)輸或轉(zhuǎn)化小鼠機(jī)體中特殊類型的細(xì)胞，并能幫助科學(xué)家們根據(jù)研究或臨床需要來(lái)選擇一種特殊病毒；天然的AAV是本文研究最有希望的出發(fā)點(diǎn)，盡管其能在人類群體中廣泛流行，但其并沒(méi)有已知的疾病關(guān)聯(lián)，而且也并不會(huì)因素宿主出現(xiàn)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，也無(wú)法自行繁殖。

研究者Ravindra Kumar說(shuō)道，如果你重新設(shè)計(jì)一種病毒來(lái)運(yùn)輸特殊的遺傳信息，并將其翻譯為一種能用于治療特性的蛋白質(zhì)，這樣就能夠從細(xì)胞源頭來(lái)治療疾病，盡管從細(xì)胞層面上理解疾病發(fā)病機(jī)制還需要科學(xué)家們進(jìn)行大量研究，但好消息是，如今這些病毒已經(jīng)被科學(xué)界用來(lái)研究細(xì)胞和疾病之間的關(guān)聯(lián)性了。所有病毒都擁有相同的基本設(shè)計(jì)，即其是由RNA或DNA的等遺傳組織組成的片段，同時(shí)由衣殼結(jié)構(gòu)所保護(hù)，AAV衣殼表面的化學(xué)特性能夠影響其粘附在細(xì)胞膜蛋白上的能力，從而就能促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞；在自然界的病毒中，衣殼能夠進(jìn)化地吸附到多種不同組織或細(xì)胞群體表面上存在的蛋白上，然而，為了使其能夠有效運(yùn)輸療法，生物工程師們就需要研究設(shè)計(jì)能夠進(jìn)入特殊細(xì)胞類型的衣殼，如果設(shè)計(jì)出的衣殼能夠吸附特定細(xì)胞類型上的膜蛋白，這一想法或許就有可能實(shí)現(xiàn)。

研究人員Gradinaru一直致力于通過(guò)利用定向進(jìn)化的力量來(lái)調(diào)查單一宿主中數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的AAV衣殼突變體，從而為不同的細(xì)胞類型和用途裝配一個(gè)病毒載體目錄，這項(xiàng)研究中，他們利用所開(kāi)發(fā)的新型M-CREATE平臺(tái)來(lái)快速篩選大量的AAV衣殼文庫(kù)，每個(gè)衣殼都攜帶有一個(gè)特殊的表面裝飾環(huán)，從而就能與不同的細(xì)胞蛋白相互作用，進(jìn)而進(jìn)入小鼠機(jī)體特殊的細(xì)胞類型中，Gradinaru說(shuō)道，基于M-CREATE平臺(tái)，我們就能單獨(dú)通過(guò)衣殼來(lái)設(shè)計(jì)成為具有細(xì)胞類型特異性的AAVs，同時(shí)并不需要基因調(diào)節(jié)元件來(lái)實(shí)現(xiàn)其特異性，并能夠在小型的AAV衣殼中為所需的遺傳物質(zhì)騰出關(guān)鍵空間。

2016年，研究人員確定了如何對(duì)AAV進(jìn)行工程化修飾來(lái)使其能跨越血腦屏障，如今這種修飾后的病毒載體就能通過(guò)簡(jiǎn)單的靜脈系統(tǒng)注射的方式來(lái)進(jìn)入機(jī)體，這樣就能夠幫助研究人員避免對(duì)大腦進(jìn)行侵襲性的注射，同時(shí)還能被廣泛用作研究工具；然而，此前的篩選過(guò)程既費(fèi)時(shí)又耗力，而且僅能識(shí)別少數(shù)幾個(gè)衣殼，也無(wú)法跨越多個(gè)目標(biāo)來(lái)進(jìn)行篩選從而揭示多個(gè)組織的衣殼特異性以及這些組織中多樣化的細(xì)胞類型。

圖片來(lái)源：Ravindra Kumar, S., et al. Nat Methods (2020). doi：10.1038/s41592-020-0799-7

M-CREATE平臺(tái)不僅能為轉(zhuǎn)化細(xì)胞類型的競(jìng)爭(zhēng)提供一個(gè)“勝利者”衣殼，而且還能提供一個(gè)最終的平臺(tái)，并同時(shí)對(duì)數(shù)千種其它衣殼突變體的適合度進(jìn)行排序；這一改進(jìn)能幫助研究人員識(shí)別出新的衣殼，其就能夠進(jìn)入血液中，優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)大腦中形成血腦屏障的神經(jīng)元或血管細(xì)胞；專門(mén)靶向作用神經(jīng)細(xì)胞或非神經(jīng)大腦細(xì)胞的工程化基因運(yùn)輸工具（比如由血管系統(tǒng)和血腦屏障組成的大腦內(nèi)皮細(xì)胞）或許能改變研究的模式；由于受損的血腦屏障會(huì)允許病理性因子進(jìn)入大腦，從而啟動(dòng)或加速神經(jīng)變性，而通過(guò)工程化的AAVs來(lái)功能性靶向作用血腦屏障的通透性就能影響機(jī)體到大腦的循環(huán)，這就能幫助研究人員修復(fù)疾病發(fā)生過(guò)程中功能被削弱的屏障，或者相反地，如果有必要的話，通過(guò)血流向大腦運(yùn)輸治療性手段就能夠暫時(shí)恢復(fù)健康血腦屏障的通透性。

此外，研究人員還是識(shí)別出了許多特殊的AAV衣殼，其能穿過(guò)血腦屏障，盡管在衣殼中設(shè)計(jì)了高度不同的序列，但其效率相似，這種新的衣殼不同于此前能展示不同菌株特異性的工程化AAVs，其在被測(cè)試的攜帶不同血腦屏障特性的小鼠中同樣有效；這就表明，新型的工程化衣殼能通過(guò)與特殊的表面蛋白相互作用來(lái)跨越血腦屏障，因此，確定其進(jìn)入相同組織的多種機(jī)制非常重要，其能將在小鼠機(jī)體中使用的工具轉(zhuǎn)化為包括人類在內(nèi)的其它研究模型。

最后研究者Gradinaru表示，新型平臺(tái)M-CREATE的開(kāi)發(fā)能夠識(shí)別擁有特殊表面結(jié)構(gòu)的多種衣殼，從而就能以不同的方式幫助解決相同的問(wèn)題，比如跨越血腦屏障等，該平臺(tái)潛在的應(yīng)用很多，比如其能將治療性基因運(yùn)輸?shù)郊膊?dòng)物模型中來(lái)研究細(xì)胞表面受體的差異，以及血腦屏障的組成。

參考資料：

【1】Targeting multiple brain cell types through engineered viral capsids

【2】Ravindra Kumar, S., Miles, T.F., Chen, X. et al.Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.Nat Methods(2020). doi：10.1038/s41592-020-0799-7