1. 差異表達的 TILRGs

在這項調(diào)查中，共發(fā)現(xiàn)了1555個 TILRG。圖1a 顯示了前50個實質(zhì)上相關(guān)的基因。在差異表達分析后，311個 DETILRG 因此被篩選(圖1b)。GO 和 KEGG 分析的結(jié)果如圖1c-f 所示。

圖1 腫瘤浸潤淋巴細胞相關(guān)基因的鑒定

2.基因模型的建立與驗證

通過單因素Cox回歸分析，訓(xùn)練組共發(fā)現(xiàn)15個預(yù)后相關(guān)TILRG（圖2a），包括 2 個保護因素（ANKRD44、SNAI3）和 13 個危險因素（RGS2、ACTN1、EFEMP1、CCDC80、GAS7、TGFB3、NRP2、FBN1、IGF1、ADAMTSL1、EDNRA、ADAMTS12 和 ATP8B2）。而網(wǎng)絡(luò)圖顯示這些等級的 TILRG 的表達水平之間的關(guān)系要清晰得多（圖2）作者進一步研究了這些TILRG在染色體上的位置以及它們是如何改變的（圖2c，d）。根據(jù)研究結(jié)果，ATP8B2最顯著的改變“增益”是在1號染色體上發(fā)現(xiàn)的，而NRP2的主要改變“損失”是在2號染色體上發(fā)現(xiàn)的。與TCGA BCa數(shù)據(jù)集中的其他TILRG相比，F(xiàn)BN1更常發(fā)生突變，根據(jù)這15個TILRG的突變和變化的oncoplot瀑布圖（圖2）。此外，圖2f表明只有幾個基因同時被改變。隨后，利用LASSO方法減少了潛在TILRG和LASSO回歸曲線的列表（圖3a） 和交叉驗證圖（圖3b） 獲得。接下來，使用套索和多元Cox分析鑒定了五個輪轂TILRG（圖3）?；颊弑环譃楦逿ILRG和低TILRG組。使用風(fēng)險評分的中值作為閾值，更好地檢查風(fēng)險特征的預(yù)后意義。作者發(fā)現(xiàn)，在TCGA訓(xùn)練，TCGA測試，TCGAall和GEO測試隊列中，高TILRGs亞組的OS比低TILRGs亞組短得多（圖3d-g）。在TCGA培訓(xùn)隊列中，1年，3年和5年OS的AUC分別為0.742,0.718和0.723（圖3）。在TCGA測試隊列中分別為0.706、0.661和0.668（圖3i），以及整個TCGA隊列中的0.733、0.705和0.697（圖3j），以及GEO測試隊列中的0.681、0.670和0.646（圖3）。此外，作者發(fā)現(xiàn)高TILRG亞組的死亡患者比例高于低TILRG亞組（圖3L-O）。

圖2 通過單變量Cox回歸分析，15個TILRG與訓(xùn)練隊列的預(yù)后顯著相關(guān)

圖3 腫瘤浸潤淋巴細胞相關(guān)基因標記的開發(fā)和驗證

3.TILRGS 的臨床應(yīng)用價值評價

根據(jù)作者的研究結(jié)果，風(fēng)險評分是 OS 的獨立預(yù)測因子(圖4a，b)。此外，在整個 TCGA 隊列中，1年、3年和5年 OS 風(fēng)險評分的 AUC 值顯著大于其他臨床變量的 AUC 值(圖4c-e)。然后，作者創(chuàng)建了一個列線圖來預(yù)測 BCa 的總生存期(圖4f)。透過校正圖及 ROC 曲線，列線圖的預(yù)測與實際觀測概率顯示出極佳的一致性和準確性(圖4g，h)。作者發(fā)現(xiàn)在整個 TCGA 隊列中，除了性別之外，風(fēng)險評分和臨床特征之間存在顯著的相關(guān)性(圖5a)。臨床特征，包括年齡，病理分級，臨床腫瘤分期和 TNM 狀態(tài)，與風(fēng)險評分高度相關(guān)(圖5b)。然而，男性和女性之間的風(fēng)險評分在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著差異。然后，根據(jù)年齡(> 65歲和 < = 65歲)、性別(男性和女性)、腫瘤分級(高級和低級)、病理 M 期(M0和 M1)、病理 N 期(N0和 N1-3)、 T 期(T0-2和 T3-4)和病理分期(I-II 和 III-IV)將 BCa 患者分為不同組進行進一步的生存分析。在大多數(shù)分層類別中，兩個風(fēng)險組之間存在顯著差異，表明低風(fēng)險組有較長的 OS (圖5c)。

圖4 生存預(yù)測列線圖的建立與評價

圖5 基因標記與TCGA數(shù)據(jù)集中BCa患者的臨床病理學(xué)特征相關(guān)

4.基于 TILRGS 的功能分析

在這里，在各個TILRGS子組之間發(fā)現(xiàn)了305個DEG。對上述DEG進行的GO和KEGG分析的結(jié)果如圖所示。6一、二.GSEA發(fā)現(xiàn)，高TILRGS亞組富含致心律失常性右室心肌病、擴張型心肌病、局灶性粘連、肥厚型心肌病和肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)（圖6c），而低TILRGS亞組在同種異體移植排斥，抗原處理和呈遞，用于IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)，嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)和原發(fā)性免疫缺陷方面富集（圖6）。GSVA富集分析顯示，兩個TILRGS亞組之間的富集途徑不同（圖6e)。

圖6 基于高風(fēng)險和低風(fēng)險組之間的差異表達基因的功能分析

5.BCa中各種TILRGS組的免疫景觀

作者使用各種免疫評估算法來檢查BCa患者兩個風(fēng)險組的免疫狀態(tài)（圖7）。根據(jù)ESTIMATE結(jié)果，低TILRGS亞組的免疫評分高于高TILRGS亞組（圖7）。如圖所示。7c.低TILRGS亞組的CD8 T細胞，記憶激活的CD4 T細胞和濾泡輔助性T細胞的比例高于高TILRGS亞組。而高TILRGS亞組的M0和M2巨噬細胞分數(shù)高于低TILRGS亞組。此外，作者發(fā)現(xiàn)低TILRGS亞組在細胞溶解活性，HLA，炎癥促進和T細胞共刺激方面的得分高于高TILRGS亞組（圖7d).

圖7 不同風(fēng)險亞組間腫瘤免疫微環(huán)境特征

6.各種風(fēng)險群體的免疫治療反應(yīng)

在目前的研究中，作者評估了幾種化療藥物對各種風(fēng)險組的IC50值。結(jié)果顯示，達沙替尼、多西他賽、伊馬替尼和帕唑帕尼在高TILRGS亞組中的IC50值低于低TILRGS亞組（圖8a），這意味著高TILRGS亞組的患者可以從上述化療中獲益更多，而吉非替尼，博舒替尼，吉西他濱和甲氨蝶呤的IC50值在低TILRGS亞組中較低（圖8b），表明低TILRGS亞組的患者可以從上述化療中獲得更多益處。在這項研究中，作者旨在評估作者的工作確定的樞紐TILRG是否是用作治療靶點的可行候選者。通過CellMiner數(shù)據(jù)庫，作者檢查了許多已獲得FDA批準或正在臨床試驗中的物質(zhì)的藥物敏感性。圖中顯示了 20 個最重要的相關(guān)性。此外，TCIA結(jié)果顯示，與高TILRGS亞組相比，低TILRGS亞組具有更高的TCIA評分（圖8d），表明這些患者可能受益于抗CTLA4和抗PD-1治療效力增加的免疫治療。

圖8 評估藥物敏感性和免疫治療

7.關(guān)鍵基因的單細胞分析

為了研究膀胱癌（BCa）TME中關(guān)鍵基因的表達，作者對GSE130001從TISCH數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)集。如圖所示。圖9，EFEMP1和ATP8B2主要在內(nèi)皮細胞中表達;ANKRD44和SNAI3主要在上皮細胞中觀察到;而IGF1主要見于肌成纖維細胞。

圖9 關(guān)鍵基因的單細胞分析

8.亞型的鑒定及其與BCa臨床結(jié)果和腫瘤免疫的關(guān)系

使用無監(jiān)督共識分析將所有TCGA BCa患者分為兩個不同的亞型（圖10）。根據(jù)作者的研究結(jié)果，第2類患者（n = 216）在總生存率方面優(yōu)于第1類患者（n = 188）（圖10）。與聚類1相比，聚類2顯示出死亡率和更高的風(fēng)險評分（圖10c，d）。在TCGA BCa數(shù)據(jù)集中，作者發(fā)現(xiàn)不同亞型與性別、病理分級、臨床分期、T分期和N分期之間存在實質(zhì)性關(guān)系（圖10）。與第1類相比，第1類女性、高級別、III-IV期、N3-3期和T4-2期患者比例更大（圖10）。接下來，作者使用不同的免疫評估算法檢查了兩個集群中的免疫景觀（圖11）。根據(jù)ESTIMATE結(jié)果，第1亞型的免疫評分高于第2亞型（圖11）。CIBERSORT算法的結(jié)果表明，與亞型2相比，亞型1表現(xiàn)出更高的記憶激活CD4 T細胞，濾泡輔助性T細胞，M2巨噬細胞，活化的樹突狀細胞和靜息肥大細胞的水平（圖11）。進一步的分析表明，就所有1個免疫相關(guān)途徑而言，聚類2優(yōu)于聚類13（圖11d）。

圖10 TCGA數(shù)據(jù)集中簽名中的五個基因的聚類分析

圖11 不同亞型間腫瘤免疫微環(huán)境特征

總結(jié)

目前的研究包含幾個缺點。首先，使用來自TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫的追溯數(shù)據(jù)，建立并驗證了基因標記。為了評估其療效和可行性，需要進行額外的大規(guī)模前瞻性臨床研究。此外，需要更多精心策劃的基礎(chǔ)研究試驗，以強調(diào)TILRG在BCa的出現(xiàn)和發(fā)展中發(fā)揮的關(guān)鍵作用?？傊?，目前的工作開發(fā)了一種基于TILRG的基因標記，可用作BCa患者預(yù)后和免疫治療反應(yīng)的有用預(yù)測因子。