據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有近1000萬(wàn)人受到酒精性肝?。ˋLD）的影響，其治療費(fèi)用每年超過(guò)1000億美元，給社會(huì)帶來(lái)了巨大的壓力。ALD的發(fā)展一般是從單純的肝脂肪變性到脂肪性肝炎，再到肝硬化，最終部分發(fā)展為肝癌。酒精性肝脂肪變性是ALD中最早的病理改變標(biāo)志，在早期有效地預(yù)防肝脂肪變性的發(fā)生有助于阻止ALD的進(jìn)展。目前對(duì)酒精性肝脂肪變性的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)做了大量的研究，但準(zhǔn)確有效的早期預(yù)警和診斷方法仍有待探索。

2023年7月7日，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)王志剛教授團(tuán)隊(duì)在《Metabolism: clinical and experimental》（IF=13.934）發(fā)表了題為：“Alcoholic Setdb1 suppression promotes hepatosteatosis in mice by strengthening Plin2”的研究論文，研究人員發(fā)現(xiàn)肝臟中的Setdb1在酒精飼養(yǎng)的小鼠中表達(dá)下調(diào)，作者用肝特異性敲除Setdb1的小鼠來(lái)闡明Setdb1抑制在酒精性脂肪肝中的具體作用和潛在機(jī)制。研究結(jié)果表明，抑制Setdb1會(huì)提高Plin2 mRNA的表達(dá)和維持Plin2蛋白的穩(wěn)定性，這在酒精性肝脂肪變性的進(jìn)展中起著重要作用，靶向肝臟Setdb1可能是ALD的一種有前途的診斷或治療策略。值得注意的是，本研究使用的Setdb1過(guò)表達(dá)腺病毒和Setdb1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及敲低質(zhì)粒均來(lái)自于漢恒生物。

研究結(jié)果

首先，作者在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)H3K9me3甲基轉(zhuǎn)移酶Setdb1在酒精性肝病模型中顯著降低，為了證實(shí)這種差異性改變，作者相繼構(gòu)建了兩種酒精飲食小鼠模型（Lieber-De Carli 模型和NIAAA模型），在這兩種模型中，Setdb1的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯降低，Setdb1的表達(dá)和H3K9me3的含量在原代肝細(xì)胞中也下調(diào)，在NIAAA小鼠模型中觀察到血清和肝臟甘油三酯水平的顯著增加。HE染色和形態(tài)學(xué)檢查顯示，與對(duì)照組相比，酒精飲食小鼠的肝臟中有嚴(yán)重的脂質(zhì)積聚。

圖1. 慢性飲酒降低小鼠肝臟Setdb1的表達(dá)和活性

為了研究Setdb1是否參與了肝脂肪變性的發(fā)病機(jī)制，作者用siRNA抑制小鼠肝細(xì)胞系-AML12細(xì)胞中Setdb1的表達(dá)。采用Bodipy、油紅O染色和電鏡技術(shù)檢測(cè)AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚情況，結(jié)果表明，在Setdb1敲低72小時(shí)后，脂滴的數(shù)量和大小均顯著增加，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇的含量也顯著提高。而Setdb1的過(guò)表達(dá)顯著抑制了AML12細(xì)胞中脂滴的產(chǎn)生并降低了甘油三酯和膽固醇的含量。這些結(jié)果表明，Setdb1對(duì)肝臟脂質(zhì)積累具有負(fù)調(diào)控作用。

圖2. Setdb1的敲低增加AML12細(xì)胞中性脂質(zhì)含量

為了進(jìn)一步確定肝臟Setdb1在體內(nèi)ALD發(fā)病機(jī)制中的作用，作者構(gòu)建了Setdb1肝臟特異性敲除的小鼠（Setdb1-HKO），HE染色等結(jié)果顯示，Setdb1-HKO小鼠的肝臟中有顯著的脂肪積聚，這些結(jié)果表明Setdb1缺乏會(huì)促進(jìn)小鼠的肝臟脂肪變性。為了進(jìn)一步研究Setdb1對(duì)肝臟脂肪變性的調(diào)節(jié)及其對(duì)酒精性肝病的保護(hù)作用，作者通過(guò)尾靜脈注射Setdb1過(guò)表達(dá)腺病毒，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Setdb1可以改善Setdb1-HKO和酒精飲食小鼠的肝脂肪變性。在兩次遞送Setdb1過(guò)表達(dá)腺病毒4周后，在兩種酒精飲食小鼠模型中，Setdb1的表達(dá)量和由Setdb1缺乏誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，Setdb1在酒精性飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

圖3. setdb1過(guò)表達(dá)腺病毒可減輕Setdb1-HKO小鼠和酒精喂養(yǎng)小鼠的肝臟脂肪變性

為了研究Setdb1對(duì)肝脂肪變性保護(hù)作用的潛在機(jī)制，作者通過(guò)分析siSetdb1處理的AML12細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)尋找與脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)脂滴相關(guān)蛋白Plin2在siSetdb1處理后，mRNA和蛋白的表達(dá)均增加，而Setdb1過(guò)表達(dá)顯著降低了Plin2的蛋白水平。此外，兩種酒精小鼠模型和Setdb1 HKO小鼠的肝臟中Plin2 mRNA和蛋白質(zhì)水平與對(duì)照相比顯著上調(diào)。將Setdb1 siRNA和Plin2 siRNA共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)抑制Plin2表達(dá)后顯著減少了Setdb1敲低誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累?？傊?，上述結(jié)果表明Plin2介導(dǎo)由Setdb1抑制引起的AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)堆積。同時(shí)，作者還通過(guò)ChIP-seq發(fā)現(xiàn)，Plin2的上游2kb序列具有顯著的H3K9me3富集，作者將該區(qū)域分為4個(gè)片段，ChIP-qPCR結(jié)果顯示，與IgG組相比，H3K9me3修飾的DNA序列在Plin2上游2kb序列的四個(gè)片段中顯著富集，而敲低Setdb1則顯著降低了片段2和片段4中的富集程度。綜上所述，抑制Setdb1通過(guò)減輕Plin2 DNA上游序列中H3K9me3修飾來(lái)促進(jìn)Plin2的轉(zhuǎn)錄。

圖4. Plin2介導(dǎo)由Setdb1抑制引起的AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)堆積

有研究發(fā)現(xiàn)AMPK的磷酸化影響Plin2的磷酸化，從而引發(fā)分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA），而Plin2相關(guān)的CMA在調(diào)節(jié)肝臟中脂滴的積聚中又起著重要作用。為了研究過(guò)表達(dá)Setdb1是否調(diào)節(jié)AMPK磷酸化并引發(fā)CMA從而導(dǎo)致Plin2表達(dá)下降，作者做了以下實(shí)驗(yàn)。通過(guò)RNAseq發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化相關(guān)基因大部分是由Setdb1調(diào)節(jié)的，作者認(rèn)為，AMPK磷酸化可以促進(jìn)Hsc70識(shí)別Plin2，這個(gè)異二聚體會(huì)被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w并與Lamp2a結(jié)合，隨之被降解。為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，作者通過(guò)WB檢測(cè)AMPK、p-AMPK等基因在Setdb1過(guò)表達(dá)的AML12細(xì)胞、腺病毒過(guò)表達(dá)Setdb1的Setdb1-HKO小鼠和酒精飲食小鼠中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p-AMPK和Lamp2a顯著升高，而Plin2顯著降低，同時(shí)，在Setdb1-HKO小鼠和酒精飲食的小鼠中，肝臟中的p-AMPK和Lamp2a顯著降低而Plin2顯著升高。為了進(jìn)一步研究Setdb1如何影響Plin2-Hsp70-Lamp2a CMA復(fù)合物的形成，作者進(jìn)行了Co-IP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Setdb1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了Plin2-Hsc70-Lamp2a CMA復(fù)合物的形成，從而導(dǎo)致Plin2的降解，而敲低則相反。所有結(jié)果表明Setdb1通過(guò)影響Plin2磷酸化招募的CMA從而調(diào)節(jié)Plin2蛋白的穩(wěn)定性。

圖5. Setdb1通過(guò)CMA負(fù)調(diào)控Plin2蛋白的穩(wěn)定性

作者隨后研究了Setdb1在ALD中的下調(diào)機(jī)制?？紤]到miRNA在ALD發(fā)展中的重要作用，作者集中研究了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的ALD小鼠模型miRNA芯片，分析得到了兩種miRNA：miR-216b-5p和miR-3474，這兩種miRNA在兩種ALD模型小鼠的肝臟中都顯著上調(diào)，miR-216b-5p的模擬物能顯著抑制Setdb1的表達(dá)并促進(jìn)Plin2的表達(dá)，抑制CMA相關(guān)蛋白的表達(dá)，而miR-3474則沒(méi)有這種作用。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-216b-5p能結(jié)合Setdb1并抑制Setdb1的表達(dá)，而miR-3474則沒(méi)有。Bodipy和油紅染色結(jié)果顯示，miR-216b-5p顯著增強(qiáng)了AML12細(xì)胞中的脂肪沉積，Setdb1過(guò)表達(dá)顯著則改善了這種情況。這些數(shù)據(jù)表明，miR-216b-5p通過(guò)抑制Setdb1和增強(qiáng)Plin2促進(jìn)肝細(xì)胞中的脂肪積累。

圖6. 酒精誘導(dǎo)的miR216b-5p有助于酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟Setdb1下調(diào)

綜上所述，文章表明，Setdb1是酒精性脂肪肝形成和發(fā)展的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)分子。Setdb1對(duì)肝脂肪變性的影響，可以一部分解釋為抑制Setdb1能增強(qiáng)肝臟Plin2的表達(dá)和抑制Plin2捕獲的CMA以及隨后脂滴中的脂質(zhì)降解從而影響酒精性肝病的進(jìn)展過(guò)程。然而，研究關(guān)于Setdb1對(duì)脂質(zhì)代謝的影響仍在進(jìn)行中，其潛在機(jī)制也需要進(jìn)一步探索，以準(zhǔn)確地為肝脂肪變性提供更多的診斷和治療方式。

圖7. 圖文摘要