苦惱嗎？你精心呵護(hù)的細(xì)胞又雙叒叕“陣亡”了…想要讓你的細(xì)胞平安健康的長(zhǎng)大嗎？快來(lái)跟著小編一起學(xué)習(xí)細(xì)胞培養(yǎng)的秘籍吧！希望大家都能順利完成實(shí)驗(yàn)，再也不用自掛東南枝了~

基礎(chǔ)概念??

細(xì)胞培養(yǎng)是指在人工創(chuàng)造的與體內(nèi)環(huán)境相似的條件下（比如適宜的溫度、pH，以及一定的營(yíng)養(yǎng)），使細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)，其中最重要的是一定要無(wú)菌！

根據(jù)細(xì)胞種類的不同細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)的不同又可分為貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。

原代培養(yǎng)是指直接從組織中分離下來(lái)的細(xì)胞，放在細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的過(guò)程。

而當(dāng)細(xì)胞不斷生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞間相互緊貼，空間小，密度大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以及代謝物累積，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，狀態(tài)變差甚至死亡，因此需要傳代培養(yǎng)來(lái)避免這種情況的發(fā)生。

傳代培養(yǎng)即將細(xì)胞消化稀釋，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中使之繼續(xù)生長(zhǎng)的過(guò)程。

一般認(rèn)為原代細(xì)胞是指從原代培養(yǎng)的第1代傳至第10代的細(xì)胞；細(xì)胞系為原代細(xì)胞首次傳代成功的細(xì)胞；細(xì)胞株則是傳代培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)的第10代至第50代細(xì)胞，其遺傳物質(zhì)較原代細(xì)胞發(fā)生改變，具有無(wú)限增殖的能力。

貼壁培養(yǎng)是指貼壁依賴型細(xì)胞貼附在一定固相表面進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程。

懸浮培養(yǎng)是指某些不具有貼壁生長(zhǎng)特性的細(xì)胞，只能在可流動(dòng)的液體培養(yǎng)基里生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程。

培養(yǎng)方法??

01 原代培養(yǎng)操作步驟

原代培養(yǎng)的操作步驟為：取材→分離→培養(yǎng)。

（1）取材：對(duì)于不同的組織有不同的取材方法（Uysal et al., 2018；司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正., 2007）具體見(jiàn)表1，但均應(yīng)保持材料的新鮮及嚴(yán)格無(wú)菌。

（2）分離：不同的組織類型采用不同的分離方法（Uysal et al., 2018；司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正., 2007）具體見(jiàn)圖1與表2。

（3）培養(yǎng)：原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法分為組織塊培養(yǎng)法、消化培養(yǎng)法、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法和器官培養(yǎng)。前兩種是最簡(jiǎn)單、常用、成功率高的方法。根據(jù)不同分離方法取得的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶后，放置于37℃?CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

02 傳代培養(yǎng)操作步驟

2.1?貼壁培養(yǎng)

細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟如下：

（1）傳代前在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)密度，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代。
（2）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液。加入PBS清洗1~2次，左右輕輕搖晃后棄掉。
（3）根據(jù)培養(yǎng)瓶大小向瓶?jī)?nèi)加入適量含EDTA的胰蛋白酶，一般應(yīng)覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底。
（4）把培養(yǎng)瓶放入37℃ CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行消化，2~5min后拿出放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有70%~80%細(xì)胞收縮變圓、細(xì)胞間隙變大時(shí)，再輕輕拍打培養(yǎng)瓶使剩余細(xì)胞脫落，然后立即加入2倍胰蛋白酶量的培養(yǎng)液中止消化，使用吸頭輕輕吹打，混合均勻，以防消化過(guò)度。
（5）吸出所有細(xì)胞懸液至離心管內(nèi)，1000rpm/min離心3~5min。
（6）棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞均勻分散。
（7）用吸頭吸取適量細(xì)胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，搖勻，放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
（8）根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)確定換液或傳代時(shí)間，甚至進(jìn)行細(xì)胞凍存。

2.2?懸浮細(xì)胞

傳代培養(yǎng)操作步驟如下：

一般實(shí)驗(yàn)室中懸浮細(xì)胞傳代方法分為直接傳代法和離心傳代法（培養(yǎng)液中含有細(xì)胞碎片的情況下）。當(dāng)在顯微鏡下觀察到懸浮細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)滿至80%~90%（細(xì)胞懸液變黃）時(shí)，即可進(jìn)行傳代。

2.2.1?直接傳代法：

（1）顯微鏡下觀察到細(xì)胞狀態(tài)良好，基本無(wú)細(xì)胞碎片。
（2）立起細(xì)胞瓶使細(xì)胞自然沉降，用吸頭吸取1/2~2/3細(xì)胞上清液，棄掉。
（3）加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，搖勻，放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2.2?離心傳代法：

（1）用吸頭吸取全部細(xì)胞懸液至離心管內(nèi)，1000rpm/min離心3~5min。
（2）棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞均勻分散。
（3）用吸頭吸取適量細(xì)胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，搖勻，放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

03 細(xì)胞凍存

（1）選取對(duì)數(shù)增生期的細(xì)胞，按照傳代的方法清洗、消化和離心。

（2）離心后棄掉上清，以適宜的密度加入適量的無(wú)血清凍存液重懸，混勻。

（3）分裝到無(wú)菌凍存管中，每管1.5mL。

（4）用封口膜封好，并做好標(biāo)記，放入液氮罐或-80℃冰箱中保存。

04 細(xì)胞復(fù)蘇

（1）取出凍存管，迅速放入37℃水浴鍋中，使其快速融化。擦干消毒后在超凈工作臺(tái)內(nèi)繼續(xù)操作。

（2）打開(kāi)蓋子，吸出細(xì)胞懸液到離心管中，再加入2倍細(xì)胞懸液量的培養(yǎng)液混勻。

（3）1000rpm/min離心3~5min。

（4）棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞均勻分散。

（5）用吸頭吸取適量細(xì)胞懸液，以適宜的密度接種于一個(gè)或多個(gè)培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，搖勻，放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

（6）次日于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況，根據(jù)情況進(jìn)行換液或傳代。之后就按常規(guī)培養(yǎng)進(jìn)行。

? 注意事項(xiàng)??

（1）嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，所用一切試劑及耗材均應(yīng)無(wú)菌，且須在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中紫外照射30min以上，以免細(xì)胞發(fā)生污染。

（2）所用培養(yǎng)液必須適宜細(xì)胞生存和生長(zhǎng)。來(lái)源于不同動(dòng)物種類、組織類型的細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)液的要求不一樣，必要時(shí)可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。

（3）胎牛血清對(duì)于維持細(xì)胞生存，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)起著關(guān)鍵作用?？筛鶕?jù)文獻(xiàn)或預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的胎牛血清。一旦確定，就應(yīng)保持用至實(shí)驗(yàn)完成。

（4）消化細(xì)胞時(shí)應(yīng)避免消化時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致消化不完全，收集到的細(xì)胞數(shù)量少，或消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)塊樣絮狀游離，這時(shí)的細(xì)胞已有損傷或死亡，影響細(xì)胞數(shù)量和實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。

（5）細(xì)胞離心的時(shí)候應(yīng)避免離心力過(guò)小收集的細(xì)胞數(shù)量不夠，或離心力過(guò)大對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。離心后的細(xì)胞沉淀?xiàng)壢ド锨搴螅瑧?yīng)先彈散細(xì)胞沉淀，再加入培養(yǎng)液重懸，這樣比直接吹打?qū)?xì)胞損傷小，可以提高細(xì)胞活率。

（6）吹打細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量避免細(xì)胞的產(chǎn)生，以免損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞狀態(tài)（吹打過(guò)程中殘留部分液體在吸頭內(nèi)可以減少氣泡的產(chǎn)生）。

? 結(jié)語(yǔ)??

養(yǎng)細(xì)胞是一件費(fèi)心費(fèi)時(shí)的大工程，就像養(yǎng)孩子，需要我們細(xì)心呵護(hù)，耐心“教導(dǎo)”，掌握好伯小醫(yī)為大家精心整理的這份秘籍，并用心去做，付出真誠(chéng)，一定會(huì)得到你想要的結(jié)果，不論什么試驗(yàn)設(shè)計(jì)，需要培養(yǎng)什么細(xì)胞都不在怕的！祝愿大家學(xué)習(xí)開(kāi)心，再也不用為細(xì)胞死亡而苦惱！

參考文獻(xiàn)

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來(lái)源：“恩典生命科學(xué)”公眾號(hào)
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