細胞轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域從山中伸彌2006年首次報道iPSC至今已有十幾年的發(fā)展，而自2010年起世界各地不同實驗室不斷驗證了體外和體內(nèi)星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的直接轉(zhuǎn)分化。諸多科學家通過各種各樣的技術(shù)路徑來實現(xiàn)轉(zhuǎn)分化，其中通過病毒載體過表達神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子是絕大多數(shù)研究者采用的方式。

陳功團隊于2013年首次報道用單個神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子NeuroD1實現(xiàn)大腦內(nèi)膠質(zhì)細胞原位轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。隨著陳功團隊在多個神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型上成功實現(xiàn)功能修復，NeuroD1所介導的原位轉(zhuǎn)分化再生神經(jīng)元的新技術(shù)也在神經(jīng)科學領(lǐng)域和生物醫(yī)藥界被廣泛關(guān)注。

近年來，張春立團隊在Cell 上發(fā)表的論文也提出了一些不同的觀點，質(zhì)疑NeuroD1、PTBP1等一些途徑介導的轉(zhuǎn)分化（前文報道：Cell：張春立團隊首次重審小鼠體內(nèi)膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，結(jié)果出乎意料！）。但我們發(fā)現(xiàn)，包括Ling Wei，Alex Chubykin、Jenny Hsieh等多位國際學者都曾先后重復過NeuroD1的實驗，證明NeuroD1可誘導星形膠質(zhì)細胞原位重編程為神經(jīng)細胞。2022年3月，美國基因治療協(xié)會上任主席Beverley Davidson實驗室用譜系示蹤小鼠成功驗證了NeuroD1介導一定程度的轉(zhuǎn)分化。隨著越來越多研究者參與研究，事實也將愈辯愈明。

近日，NeuExcell Therapeutics創(chuàng)始人，暨南大學粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院陳功教授團隊在bioRxiv（預印平臺）上發(fā)表題為“Enhancing NeuroD1 Expression to Convert Lineage-Traced Astrocytes into Neurons”的文章，指出了NeuroD1介導的未能實現(xiàn)轉(zhuǎn)分化的原因，提供了雙光子活體成像觀察到體內(nèi)星形膠質(zhì)細胞直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元等有力證據(jù)，掃清了轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域的部分疑云，為該技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定了更加堅實的基礎(chǔ)。

此項研究是首次對NeuroD1誘導的星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元原位轉(zhuǎn)分化的系統(tǒng)性分析，運用一系列不同啟動子，在一系列不同滴度下，并在一系列不同基因背景的小鼠腦子里，從不同角度證明了星形膠質(zhì)細胞可以原位轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。

針對Cell 論文報道的神經(jīng)元“泄露”現(xiàn)象，陳功團隊構(gòu)建了三種AAV載體，通過星形膠質(zhì)細胞（Astrocyte）特異的GFAP啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白（GFP）的表達，在小鼠大腦皮層測試了1011、1012、1013GC/ml 三種不同滴度。

實驗發(fā)現(xiàn)無論使用哪種啟動子，在1013GC/ml的高滴度下均出現(xiàn)了嚴重的神經(jīng)元泄露現(xiàn)象；但是在1011GC/ml、1012GC/ml滴度下都保持很高的星形膠質(zhì)細胞特異性，很少有神經(jīng)元泄露。因此，Cell 論文中基于>1013GC/ml高滴度產(chǎn)生的神經(jīng)元泄露而全面挑戰(zhàn)原位轉(zhuǎn)分化技術(shù)的結(jié)論是不可靠的。

高滴度AAV引起劑量依賴性神經(jīng)元滲漏

針對Cell 論文中未能將譜系示蹤的星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的失敗結(jié)果，陳功團隊也分享了該領(lǐng)域的一些研究訣竅，即“譜系示蹤的星形膠質(zhì)細胞比正常膠質(zhì)細胞更難轉(zhuǎn)分化，需要用增強子來加強NeuroD1的表達才能夠克服轉(zhuǎn)分化的阻力，實現(xiàn)原位神經(jīng)再生”。

陳功團隊首先證明NeuroD1介導的轉(zhuǎn)分化呈劑量依賴效應(yīng)，也就是NeuroD1的表達水平越高，轉(zhuǎn)化效率就越高。為了避免使用高滴度病毒，陳功團隊設(shè)計了在GFAP::NeuroD1 的載體中引入CMV enhancer 來加強NeuroD1的表達，成功地將譜系示蹤的星形膠質(zhì)細胞（Aldh1l1-CreERT2xAi14）轉(zhuǎn)化成為神經(jīng)元。

用CMV enhancer增強NeuroD1的表達可以提高譜系示蹤的星形膠質(zhì)細胞到神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化效率

更進一步的是，陳功團隊又運用雙光子活體成像技術(shù)直接捕捉到了小鼠大腦皮層里的星形膠質(zhì)細胞一步一步地逐漸轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的動態(tài)過程，而且再次在譜系示蹤的轉(zhuǎn)基因小鼠上觀察到事先標記的紅色星形膠質(zhì)細胞逐漸收縮起很多細小的分枝，轉(zhuǎn)化成了紅色的有頂樹突的神經(jīng)元。

雙光子活體成像技術(shù)影像圖

，時長00:21這段視頻展現(xiàn)的是雙光子活體腦影像觀察，紅色譜系示蹤的星形膠質(zhì)細胞在表達了 NeuroD1 后15天時大多還是膠質(zhì)細胞形態(tài)，但到了第35天時則有許多轉(zhuǎn)化成了紅色神經(jīng)元。

至此，陳功團隊構(gòu)建了多種AAV載體，在多種基因遺傳背景的小鼠上都實現(xiàn)了星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化，有力地證明了星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化的事實，也為此前Cell 論文中做不出轉(zhuǎn)分化提供了一些參考。

總 結(jié)

基于以上的研究結(jié)果，陳功團隊提出了清晰的轉(zhuǎn)分化過程，為整個轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域指明了方向。他們指出，轉(zhuǎn)分化的前提應(yīng)該是首先在星形膠質(zhì)細胞的細胞核里檢測到神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達，然后觀察到這些膠質(zhì)細胞發(fā)生形態(tài)學變化，并且逐漸失去膠質(zhì)細胞特異的標志物，同時逐漸獲得神經(jīng)元特異的標志物，先轉(zhuǎn)化為未成熟神經(jīng)元，再進一步分化成熟。通常在轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元里也能夠檢測到轉(zhuǎn)錄因子的表達。如果沒有轉(zhuǎn)分化，神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子是不可能從膠質(zhì)細胞的核里跳到神經(jīng)元的核里去的。

在文章的討論部分，陳功團隊將他們十多年積累的寶貴經(jīng)驗都毫無保留地貢獻出來。他們總結(jié)了轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域?qū)τ谏窠?jīng)元泄漏的誤解，指出因為AAV會同時感染神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，因此，當注射大量AAV進行膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化時，神經(jīng)元泄漏是不可避免的現(xiàn)象，大家能做的是盡量降低泄漏的比例，增加轉(zhuǎn)分化的比例。更重要的是，膠質(zhì)細胞原位轉(zhuǎn)分化的目的是要再生神經(jīng)元，治療因為神經(jīng)損傷而導致的疾病。

因此，陳功團隊告誡大家不要向正常的大腦里注射大量的病毒去做轉(zhuǎn)分化，那樣勢必把好好的膠質(zhì)細胞變成多余的神經(jīng)元，只會打破正常的神經(jīng)-膠質(zhì)平衡。真正有意義的轉(zhuǎn)分化應(yīng)該在神經(jīng)損傷和退行性病變的組織里將應(yīng)激性膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元，重構(gòu)神經(jīng)環(huán)路，修復大腦，造福人類。

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