研究對(duì)象：菊苣

發(fā)表期刊：frontiers in plant science

影響因子：4.402

作者介紹：美國(guó)佐治亞大學(xué)祁澎博士（Super-GBS技術(shù)顧問(wèn)）參與發(fā)文

涉及的歐易生物服務(wù)產(chǎn)品：Super-GBS

●?研究背景

菊苣是一種葉菜類植物，隸屬于菊科菊苣屬，由于其孢子體自交不親和系統(tǒng)，是一種異花授粉的二倍體植物(2n = 18)。此外，異花授粉還受到一些性狀的推動(dòng)，包括: (i)花形態(tài)物候?qū)W(即，花藥先于雌蕊成熟，從而無(wú)法完成自交) ; (ii)異源花粉粒和花粉管的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)(即花粉的基因型與父母本不同)。

基于分子標(biāo)記的高密度連鎖圖譜在作物遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究中起著關(guān)鍵作用，其發(fā)展簡(jiǎn)化了質(zhì)量和數(shù)量性狀基因座(QTL)的研究。第一個(gè)菊苣的遺傳連鎖圖譜覆蓋878 cM, 包含431個(gè)SSR和41個(gè)EST標(biāo)記。隨后，核雄性不育 (NMS1)位點(diǎn)和孢子體自交不親和(SSI)位點(diǎn)被分別定位在根菊苣的第五和第二連鎖群上。同時(shí)，雄性不育基因(MS1)被定位在葉菊苣的第4連鎖群中。最近的研究，一個(gè)覆蓋了1208 cM的遺傳連鎖圖譜被成功繪制，將其與萵苣的基因組進(jìn)行同源比對(duì)共發(fā)現(xiàn)了27對(duì)可能的同源染色體片段，覆蓋了11%的菊苣基因組和13%的萵苣基因組，為這兩個(gè)物種的比較分析開(kāi)辟了新的途徑。

對(duì)于菊苣自交不親和和雄性不育位點(diǎn)的遺傳連鎖定位不僅在了解開(kāi)花植物中主要生殖障礙的遺傳基礎(chǔ)具有重要意義，而且在雜交F1品種的選育中，這些位點(diǎn)也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

●?研究?jī)?nèi)容

本研究利用基于菊苣和萵苣中27個(gè)同源連鎖群上的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)和葉菊苣基因組序列草圖成功構(gòu)建了葉菊苣的高密度連鎖圖譜，并精確定位了葉菊苣的雄性不育(ms1)位點(diǎn)。首先利用SSR和EST標(biāo)記對(duì)ms1基因位點(diǎn)進(jìn)行初步遺傳定位后，然后采用基因分型-測(cè)序(GBS)方法縮小ms1基因的染色體位置，建立ms1基因飽和連鎖群，篩選雄性不育的分子標(biāo)記和候選基因，為之后的標(biāo)記輔助育種和基因克隆建立良好的基礎(chǔ)。

●?實(shí)驗(yàn)材料

本研究通過(guò)田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一些與ms1位點(diǎn)表型相同的雄性不育突變體。為了最大限度地提高遺傳多樣性和多態(tài)性水平，將培育的菊苣種群中的雄性不育突變株(基因型 msms)與當(dāng)?shù)匾吧哲闹械男坌钥捎?基因型 MsMs)進(jìn)行雜交。利用F1后代中雜合的雄性可育株?(Msms 基因型)進(jìn)行自交，再將F2子代中的雄性不育子代(msms 基因型)與F1后代中雜合的雄性可育株?(Msms 基因型)進(jìn)行回交，得到由198株單株組成的分離群體，其中雄性可育株與雄性不育株的比例為1:1。為進(jìn)一步明確該基因，對(duì)198個(gè)BC1的雜交群體進(jìn)行了遺傳連鎖圖譜定位分析。

圖1 為定位菊苣雄性不育基因而開(kāi)發(fā)的育種群體示意圖

●?研究結(jié)果

1.基于SSR標(biāo)記的雄性不育基因的遺傳定位

基于之前研究以獲得的菊苣的微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記，對(duì)198株子代植株進(jìn)行多重SSR基因型分析，初步篩選出兩個(gè)與ms1位點(diǎn)緊密連鎖的SSR標(biāo)記(M4.12和M4.11b)，與ms1位點(diǎn)的距離分別為5.8 cM和12.1 cM。?這些SSR標(biāo)記在基因組中的比對(duì)結(jié)果證明了ms1位點(diǎn)被定位在菊苣圖譜的第四連鎖群上。

圖2 分子標(biāo)記定位在連鎖群4上，發(fā)現(xiàn)與葉菊苣雄性不育位點(diǎn)(ms1)相關(guān)。(A)連鎖群4圖譜。(B)三個(gè)SSR標(biāo)記(紅色)、一個(gè)來(lái)自MADS-box區(qū)域的CAPS標(biāo)記(藍(lán)色)和雄性不育基因位點(diǎn)之間的遺傳距離。(C)連鎖群9?；?4個(gè)BC1群體樣本，使用測(cè)序基因分型(Super-GBS)方法構(gòu)建。紅色表示已用于第一次SSR方法的兩個(gè)SSR，粗體表示與ms1位點(diǎn)距離≤3個(gè)重組子的13個(gè)SNP。(D)ms1位點(diǎn)周圍的染色體區(qū)域。

2.通過(guò)GBS技術(shù)建立基于SNP的菊苣連鎖圖譜

利用GBS方法對(duì)BC1群體的22個(gè)雄性不育株和22個(gè)可育株組成的子代進(jìn)行連鎖分析，建立了基于SNP的菊苣遺傳連鎖圖譜，并確定了與ms1位點(diǎn)相關(guān)的標(biāo)記。該連鎖圖譜包含727個(gè)SNP群集，分布在9個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)度為1,413cM。ms1位點(diǎn)與M4.10b和M4.12 兩個(gè)SSR標(biāo)記一起被定位到該遺傳圖譜中的第9連鎖群上，其中M4.12與ms1位點(diǎn)共分離，定位于ms1位點(diǎn)7.8 cM處。另外，13個(gè)SNP位點(diǎn)與ms1緊密相連，其中7個(gè)SNP標(biāo)記(T11292、T4393、T4402、T4399、T4401、T4390和T4395)在44個(gè)BC1后代群體中與ms1共分離。

圖3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

3.與ms1位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)的驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)另外64個(gè)BC1子代(32個(gè)雄性不育子代和32個(gè)可育子代)的分析去驗(yàn)證了13個(gè)雄性不育相關(guān)SNP的位置。基于108個(gè)子代的連鎖分析，13個(gè)SNPs均定位在連鎖群9的9.9 cM區(qū)域，其中4個(gè)SNPs (T11292、T4393、T4401和T4402)與ms1位點(diǎn)共分離(圖2-D)。

4.?MYB103被篩選作為雄性不育的候選基因通過(guò)對(duì)菊苣和萵苣基因組的同源性比對(duì)

利用萵苣基因組作為數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)含有13個(gè)與ms1緊密連鎖的SNPs的contigs進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中有10個(gè)同源性很高(E-value <1E-20)，而且均位于5號(hào)染色體18 Mbp的邊緣區(qū)域。在萵苣基因組的同一染色體區(qū)域，定位了一個(gè)來(lái)自MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子MYB103，它是擬南芥花藥發(fā)育所需的功能因子，編碼一個(gè)參與四分體胼胝質(zhì)溶解和小孢子外壁發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，因此選擇這個(gè)同源基因作為雄性不育的候選基因。選擇8種菊苣品種(即4個(gè)雄性不育突變體ms1ms1和4個(gè)雄性可育自交系Ms1ms1)進(jìn)行MYB103基因的擴(kuò)增驗(yàn)證，序列比對(duì)表明雄性不育突變體的第二外顯子中檢測(cè)到4個(gè)核苷酸(TTAA)的插入，這種多態(tài)性隨后通過(guò)等位基因特異性PCR在64株BC1群體后代中進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MYB103與ms1位點(diǎn)共分離。進(jìn)一步研究表明該插入突變能夠?qū)е翸YB103在雄性不育突變體中提前終止翻譯，引起翻譯后的蛋白123個(gè)氨基酸的缺失。

圖 4 MYB103基因的獲得及插入片段標(biāo)記PCR驗(yàn)證。(A)萵苣5號(hào)染色外圍區(qū)域與菊苣ms1位點(diǎn)周圍9.9cM的DNA區(qū)域之間的微中同線性表明MYB103可能參與雄性不育。(B)8個(gè)MYB103序列的比對(duì)。4個(gè)測(cè)序來(lái)自雄性可育野生型(WT)，4個(gè)測(cè)序自雄性不育材料(ms)，突出顯示后一組的第二外顯子中插入了四個(gè)堿基。插入引入了一個(gè)早熟的終止密碼子，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)縮短了123個(gè)氨基酸。(C)使用MYB103等位基因特異性引物在雄性不育突變體(ms)、雄性可育野生型(WT)親本和8個(gè)BC1子代植物的代表性子集(分離1 Msms:1 msms)中生成的AS-PCR圖譜示例。

小歐解讀

1.本研究是在菊苣上構(gòu)建的第一個(gè)基于SNP的連鎖圖譜，并完成該物種不育性狀的分子定位。

2.深入理解核雄性不育系統(tǒng)對(duì)于植物育種的開(kāi)發(fā)極為重要，因?yàn)樾坌圆挥窃谧魑镏信嘤?F1雜交品種的最有效方法之一。

3.MYB103與ms1完全分離，進(jìn)一步證實(shí)了它可能是導(dǎo)致菊苣雄性不育的原因。

文末看點(diǎn)

Super-GBS是基于GBS進(jìn)一步發(fā)展出的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，其原理是使用限制性核酸內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切，然后對(duì)酶切片段進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)分析獲得SNP信息并進(jìn)行基因分型，是一種快速、簡(jiǎn)便、低成本的基因分型方法。

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● 參考文獻(xiàn)

Palumbo F , Peng Q , Pinto V B , et al. Construction of the First SNP-Based Linkage Map Using Genotyping-by-Sequencing and Mapping of the Male-Sterility Gene in Leaf Chicory[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10:276.