銅綠假單胞菌是一種常見(jiàn)的封裝革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，可導(dǎo)致動(dòng)植物（包括人類）患病。銅綠假單胞菌（Pseudomonas? aeruginosa）是具有重要醫(yī)學(xué)意義的物種，并且是具有多種耐藥性的病原體。由于其普遍存在，固有的先進(jìn)耐藥機(jī)制以及與嚴(yán)重疾?。ㄈ绾粑鼨C(jī)相關(guān)性肺炎和呼吸道炎癥）等關(guān)系以及公認(rèn)的敗血癥綜合征與醫(yī)院感染有關(guān)，因此這種細(xì)菌通常在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，例如銅綠假單胞菌是革蘭氏陰性需氧桿狀細(xì)菌，屬于假單胞菌家族（一種γ-變形桿菌）。近年來(lái)，銅綠假單胞菌在CRISPR編輯領(lǐng)域變得越來(lái)越流行。它涉及基因敲除技術(shù)，基因敲入和細(xì)菌中的點(diǎn)突變。

CRISPR在銅綠假單胞菌中涉及標(biāo)簽基因插入和敲除的應(yīng)用

銅綠假單胞菌既是原型多藥抗性（MDR）病原體，又是CRISPR-Cas研究的模型物種。在包括I-F CRISPR的臨床環(huán)境中，該技術(shù)可以輕松應(yīng)用于銅綠假單胞菌的其他兩種分離株。進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了兩步In-Del策略，其中涉及在所需的編輯位點(diǎn)附近插入標(biāo)簽，然后執(zhí)行基因敲除以編輯缺少有效PAM（原型間隔子相鄰基序）或必需基因敲除細(xì)胞的基因組位點(diǎn)。在三個(gè)增強(qiáng)氟喹諾酮類藥物，耐藥性突變中，與MexAB-OprM或MexEF-OprN的外排相比，gyrA突變引起更大的耐藥性。這些結(jié)果促進(jìn)了對(duì)臨床銅綠假單胞菌菌株MDR發(fā)展的理解，并證明了天然CRISPR系統(tǒng)在AMR研究中的巨大潛力。盡管在各種模型菌株中都有完整的遺傳操作工具，但是由于這些菌株的DNA穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞毒性的多樣性，它們?cè)卺t(yī)學(xué)，環(huán)境和工業(yè)意義上在“非模型”菌株中的應(yīng)用常常受到影響，阻礙。CRISPR-Cas9/Cpf1系統(tǒng)的克隆。具有內(nèi)置基因組靶向活性并廣泛分布于原核生物中的天然CRISPR-Cas系統(tǒng)的使用為解決這些障礙提供了一種有前途且有效的方法。第一項(xiàng)由I-F CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的成功開(kāi)發(fā)及其擴(kuò)展到其他臨床和環(huán)境銅綠假單胞菌分離株。敲除細(xì)菌為病原體抗性功能基因組學(xué)開(kāi)辟了新途徑。

銅綠假單胞菌的沉默和點(diǎn)突變有助于細(xì)菌生理學(xué)，藥物靶標(biāo)探索和代謝工程研究

假單胞菌物種具有重要的生物醫(yī)學(xué)，生態(tài)和工業(yè)重要性。盡管有廣泛的研究和廣泛的應(yīng)用，但是在假單胞菌屬物種，特別是在人類主要病原體銅綠假單胞菌中的遺傳操作仍是一項(xiàng)艱巨的努力。據(jù)報(bào)道，通過(guò)使用CRISPR/Cas9和噬菌體λ-Red重組系統(tǒng)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基因組編輯方法pCasPA/pACRISPR。該方法允許在銅綠假單胞菌中進(jìn)行有效且無(wú)疤的遺傳操作。通過(guò)工程化的胞苷脫氨酶APOBEC1和Cas9切口酶的融合，開(kāi)發(fā)了一種堿基編輯系統(tǒng)pnCasPA-BEC，它可以敲除多種銅綠假單胞菌和敲除大腸桿菌，從而實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變中的高效基因。兩種基因組編輯方法的應(yīng)用將大大加速各種研究，例如細(xì)菌生理學(xué)研究，藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和代謝工程。

以堿基對(duì)精度快速構(gòu)建銅綠假單胞菌基因敲除

銅綠假單胞菌是用于研究群體感應(yīng)，生物膜形成以及免疫系統(tǒng)較弱的患者醫(yī)院感染的主要原因的模型生物。因此，就其遺傳學(xué)而言，銅綠假單胞菌是研究最多的生物之一。然而，在銅綠假單胞菌中構(gòu)建和替換基因KO是相對(duì)耗時(shí)的并且需要多個(gè)步驟，包括自殺載體的構(gòu)建，綴合，抗生素抗性盒插入，失活和等位基因交換。甚至網(wǎng)關(guān)重組技術(shù)和直接轉(zhuǎn)換的組合也至少需要兩個(gè)星期。因此，開(kāi)發(fā)了一種快速，簡(jiǎn)化的方法，無(wú)需直接創(chuàng)建兼容Gateway的自殺載體，即可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化在銅綠假單胞菌中創(chuàng)建干凈的KO突變體。在這種方法中，要?jiǎng)h除的基因/基因座的上游和下游序列通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增，并與線性酶無(wú)縫融合。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

References:

Zeling Xu, Ming Li, Yanran Li, Huiluo Cao, Hua Xiang, Aixin Yan.?Native CRISPR-Cas mediated in situ genome editing reveals extensive resistance synergy in the clinical multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa.?bioRxiv 496711.

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Huang, Weiliang, and Angela Wilks. “A rapid seamless method for gene KO in Pseudomonas aeruginosa.” BMC microbiology vol. 17,1 199. 19 Sep. 2017, doi:10.1186/s12866-017-1112-5.

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