532年2月23日，在“偉大的教堂”（Magna Ecclesia）被摧毀后的僅僅數(shù)天，皇帝查士丁尼一世決定興建第三代截然不同的大教堂，較前兩所更為宏大雄偉。

查士丁尼一世選用物理學(xué)家米利都的伊西多爾(??σ?δωρο? ? Μιλ?σιο?）和數(shù)學(xué)家特拉勒斯的安提莫斯?(??νθ?μιο? ? Τραλλιαν??）為建筑師，但安提莫斯在不足一年內(nèi)逝世。拜占庭史學(xué)家普羅科比在《建筑》一書里描述了建造圣索菲亞大教堂的狀況：皇帝將帝國各地的物料運(yùn)送到君士坦丁堡，如以弗所阿耳忒彌斯神廟的古希臘圓柱。大石都是來自遠(yuǎn)處的采石場(chǎng)，包括埃及的斑巖、色薩利的綠色大理石、博斯普魯斯海峽地區(qū)的黑石及敘利亞的黃石。超過一萬人參與建造工作，這所新教堂馬上就被認(rèn)為是重要的建筑，展示了建筑師的創(chuàng)造力。建筑師們采用了希羅的理論，在廣大的空間之上建造巨大的圓頂?；实叟c牧首梅納斯（Μην??）在537年12月27日一起參與了盛大的落成儀式。教堂內(nèi)的鑲嵌畫則在查士丁二世在位時(shí)才完成。

553年8月及557年12月的地震使主圓頂及東面的半圓頂破裂，558年5月7日發(fā)生的地震使主圓頂徹底倒塌，破壞了讀經(jīng)臺(tái)、祭壇及其華蓋?；实垴R上下令修復(fù)，讓米利都的伊西多爾（Isidore of Miletus）的侄子伊西多拉（Isidorus）負(fù)責(zé)修復(fù)工作。他使用了較輕的建材，又將圓頂提高了6.25米，使教堂的內(nèi)部高度達(dá)到現(xiàn)時(shí)的55.6米。修復(fù)工程在562年完成，使教堂在6世紀(jì)的面貌得以保存至今。拜占庭詩人示默者保羅（Paul the Silentiary）為教堂的重建創(chuàng)作了一首名為《讀畫詩》的長詩。562年12月23日，牧首優(yōu)迪基烏（Eutychius）主持落成儀式。

726年，拜占庭皇帝利奧三世頒布一系列的詔令抵制偶像崇拜，命令軍隊(duì)摧毀一切圣像，迎來了毀壞圣像運(yùn)動(dòng)。圣索菲亞大教堂內(nèi)的所有宗教畫像及雕像被移除。在伊琳娜女皇執(zhí)政時(shí)期（797年－802年），圣像崇拜得到短暫的恢復(fù)，此后偶像破壞卷土重來。拜占庭皇帝狄奧菲洛(Theophilos)深受伊斯蘭藝術(shù)影響，而伊斯蘭藝術(shù)是禁止偶像崇拜的。他將刻有畫押字的青銅兩翼門安裝在大教堂的南面入口。859年的大火對(duì)大教堂造成破壞，而869年1月8日的地震使一個(gè)半圓頂?shù)顾?，巴西爾一世下令?fù)修。989年10月25日發(fā)生強(qiáng)烈地震，破壞了大教堂的大圓頂，巴西爾二世委托亞美尼亞建筑師、阿尼及阿吉涅大教堂的創(chuàng)造者梯利達(dá)特（Trdat）修復(fù)圓頂，西面的圓拱及部分大圓頂是他主要的修復(fù)部分。大教堂的損毀程度使修復(fù)工作持續(xù)了六年，大教堂在994年5月13日重新開放。

在第四次十字軍東征期間，大教堂被拉丁人洗劫。在拉丁帝國的占領(lǐng)下，圣索菲亞大教堂成為了羅馬天主教會(huì)的主教座堂。鮑德溫一世于1204年5月16日在圣索菲亞大教堂加冕為皇帝，儀式嚴(yán)格遵循拜占庭的傳統(tǒng)。威尼斯公爵恩里科·丹多洛被葬在教堂內(nèi)，碑文顯示了他的名字，成為了地面裝飾。在19世紀(jì)，一個(gè)意大利的修復(fù)小組在可能的位置附近放置了一個(gè)紀(jì)念碑標(biāo)記，經(jīng)常被誤認(rèn)為是中世紀(jì)的文物，今天仍然可見。最初的墳?zāi)乖诮烫酶慕榍逭嫠碌倪^程中被奧斯曼帝國摧毀。

1261年，尼西亞帝國皇帝米海爾八世占領(lǐng)君士坦丁堡后，大教堂已顯得相當(dāng)破敗，西面的四道扶壁大概就是在這時(shí)加建。1317年，安德洛尼卡二世在教堂東部及北部加建四道扶壁。1344年10月的地震使教堂的圓頂崩裂，部分建筑在1346年5月19日倒塌，教堂在此后關(guān)閉。1354年，建筑師阿斯特拉及佩拉爾塔負(fù)責(zé)教堂的修繕工作。

1452年12月12日，基輔的伊西多爾(Isidore)在圣索菲亞大教堂宣布了人們期待已久的西方天主教和東方東正教的聯(lián)合，該聯(lián)合由佛羅倫薩會(huì)議(Council of Florence)決定，并由教皇頒布：“Bull of Union with the Greeks”，盡管它將是短暫的。聯(lián)合在拜占庭人中不受歡迎，他們已經(jīng)驅(qū)逐了君士坦丁堡大牧首格里高利三世，因?yàn)樗С致?lián)合的立場(chǎng)。直到奧斯曼帝國征服后才任命了新的大主教。根據(jù)同時(shí)期拜占庭歷史學(xué)家杜卡斯（Doukas）的說法，圣索菲亞大教堂被這些天主教的聯(lián)系所玷污，反聯(lián)盟的東正教信徒們避開了大教堂，認(rèn)為它是惡魔出沒的地方，是古羅馬異教的“希臘化”寺廟。杜卡斯還指出，在教皇宣布聯(lián)合后，羅馬人不滿地分散到附近的場(chǎng)所，在那里他們向Hodegetria圣像敬酒，根據(jù)拜占庭時(shí)期的傳統(tǒng)，在阿瓦爾汗國和倭馬亞哈里發(fā)國圍攻君士坦丁堡時(shí)，Hodegetria圣像曾為他們祈禱并拯救了他們。