寫在前面

????????今天推薦的是由美國克利夫蘭醫(yī)學(xué)中心癌癥生物學(xué)系在2019年12月19日發(fā)表于Nucleic Acids Research（2020IF：16.971，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Alexandru Almasan教授，研究表明AUSP14是Ku70的去泛素酶，是自噬和PTEN缺陷細(xì)胞中非同源末端連接修復(fù)的關(guān)鍵因素。

研究背景

????????放療 (RT) 是一種非常有效的治療方式，可用于局部控制許多癌癥組織學(xué)。雖然RT通過在細(xì)胞中誘導(dǎo)致命的DNA雙鏈斷裂 (DSB) 來根除腫瘤，但腫瘤細(xì)胞DSB修復(fù)途徑有助于抵抗治療。因此，揭示可以限制或抑制癌細(xì)胞DSB修復(fù)的新機制有望提高放療控制腫瘤細(xì)胞生長和存活的有效性。

摘要部分

????????作者將去泛素化酶USP14鑒定為一種新型自噬底物和IR誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng) (DDR) 信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑。自噬的抑制增加了USP14的水平和DSB募集。USP14抑制RNF168 依賴性泛素信號傳導(dǎo)和下游53BP1染色質(zhì)募集。作者數(shù)據(jù)顯示自噬缺陷細(xì)胞在NHEJ中存在缺陷。此外，在自噬缺陷細(xì)胞中，關(guān)鍵NHEJ蛋白的染色質(zhì)募集減少。USP14過表達(dá)恢復(fù)了自噬缺陷細(xì)胞中NHEJ-DDR 蛋白的活性。質(zhì)譜分析確定了USP14與核心NHEJ蛋白（包括 Ku70）的相互作用，這也通過免疫共沉淀進(jìn)行了驗證。一項體外測定顯示USP14靶向Ku70進(jìn)行去泛素化。AKT介導(dǎo)Ser432-USP14磷酸化，是USP14形成IRIF所必需的。與USP14阻斷類似，AKT抑制恢復(fù)了自噬和 PTEN 缺陷細(xì)胞中NHEJ-DDR 蛋白的活性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了USP14對NHEJ的新型PTEN/Akt依賴性負(fù)調(diào)節(jié)。

研究內(nèi)容

1.自噬抑制導(dǎo)致USP14 IRIF形成增加??? ?

????????作者最近將USP14確定為自噬和DSB修復(fù)信號之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作者發(fā)現(xiàn)抑制自噬會上調(diào)USP14，反過來，它對RNF168進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，RNF168是一種 E3 Ub連接酶，對于DNA DSB上的53BP1募集至關(guān)重要。由于53BP1募集對于NHEJ的下游激活至關(guān)重要，因此作者研究了USP14在調(diào)節(jié)NHEJ修復(fù)以響應(yīng)自噬缺陷細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的DNA損傷中的作用。? ? ?

????????為了研究自噬的作用，作者使用氯喹 (CQ)或使用強力霉素 (dox)誘導(dǎo)ATG7敲低的方法。接下來，作者監(jiān)測了細(xì)胞溶質(zhì) LC3-I轉(zhuǎn)化為LC3-II的情況。作者發(fā)現(xiàn)dox誘導(dǎo)后，表達(dá)shATG7的LNCaP細(xì)胞中LC3-II水平降低，而且未用Dox處理的細(xì)胞LC3-II表達(dá)增高。這些數(shù)據(jù)證實shATG7誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞缺乏針對IR的自噬響應(yīng)。

????????接下來，為了研究USP14在調(diào)節(jié)自噬缺陷細(xì)胞中DNADSB反應(yīng)中的作用，作者研究USP14向DSB的募集。自噬的抑制導(dǎo)致dox+ LNCaP和CQ預(yù)處理的C4-2細(xì)胞中具有更高的染色質(zhì)結(jié)合USP14。與USP14在調(diào)節(jié)RNF168和53BP1染色質(zhì)募集中的作用一致，自噬抑制導(dǎo)致USP14水平增加進(jìn)而導(dǎo)致IR誘導(dǎo)的染色質(zhì)結(jié)合RNF168和53BP1減少，表明這些細(xì)胞中的NHEJ信號受損。另一方面，在IR處理后的所有時間點，表達(dá)shATG7的LNCaP細(xì)胞中USP14病灶的數(shù)量都增加了。在IR處理前用USP14抑制劑IU1預(yù)處理的shATG7表達(dá)細(xì)胞中USP14 IRIF形成顯著減少，表明USP14的催化活性是其募集到DSB位點所必需的。

研究結(jié)論：自噬抑制導(dǎo)致SP14 IRIF形成增加。

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2.USP14調(diào)節(jié)NHEJ相關(guān)的DDR信號? ? ?

????????作者研究了在dox誘導(dǎo)型shATG7表達(dá) LNCAP細(xì)胞中響應(yīng)IR的DDR信號傳導(dǎo)H2AX病灶的形成是DSBs的金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記，在IR誘導(dǎo)后短時間，是否dox誘導(dǎo)對H2AX病灶的形成無影響，然而在24小時后，僅在無dox誘導(dǎo)的shATG7 表達(dá)細(xì)胞中觀察到顯著減少的 H2AX病灶，表明自噬缺陷細(xì)胞中的DSB修復(fù)受損。此外，在自噬缺陷（dox+）細(xì)胞中，RNF168和 53BP1 IRIF的形成大大減少。另一方面，使用IU1對USP14的藥理學(xué)抑制可以顯著恢復(fù)DSB修復(fù)，并恢復(fù)dox+ 細(xì)胞中RNF168和53BP1的IRIF?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，誘導(dǎo)型shATG7表達(dá)細(xì)胞通過USP14調(diào)節(jié) DDR信號傳導(dǎo)。

????????RIF-1是一種抗DNA切除因子，它被募集到磷酸化53BP1下游的DSB位點，其作用是抑制導(dǎo)致HR的DNA切除，從而促進(jìn)NHEJ。因此，作者評估了RIF1是否與IU1處理的自噬缺陷細(xì)胞中的53BP1病灶形成相關(guān)。事實上，在自噬缺陷細(xì)胞中，RIF1 IRIF的數(shù)量減少。

研究結(jié)論：USP14負(fù)調(diào)節(jié)與NHEJ相關(guān)的DDR信號，以響應(yīng)自噬缺陷細(xì)胞中的IR。

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3.USP14阻止核心NHEJ蛋白的染色質(zhì)募集? ? ?

????????作者隨后研究了USP14在通過染色質(zhì)提取調(diào)節(jié)NHEJ核心復(fù)合物響應(yīng)IR的募集中的作用。核心NHEJ復(fù)合蛋白，包括Ku70、Ku80、DNA-PKcs和XLF，被招募到自噬正常細(xì)胞中的染色質(zhì)以響應(yīng)IR處理。然而，在自噬缺陷細(xì)胞中響應(yīng) IR，NHEJ核心因子的染色質(zhì)募集顯著減少。有趣的是，在IU1處理的細(xì)胞中，Ku70、Ku80、DNA-PKcs和XLF的募集在自噬缺陷細(xì)胞中得到了有效恢復(fù)。DNA DSB上的NHEJ復(fù)合物組裝對于有效的NHEJ修復(fù)至關(guān)重要。因此，接下來作者使用宿主細(xì)胞再激活報告基因測定探究USP14是否調(diào)節(jié)NHEJ DNA修復(fù)。作者發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，表達(dá)shUSP14的C4-2細(xì)胞的NHEJ水平顯著增加?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明USP14確實調(diào)節(jié)了自噬缺陷細(xì)胞中的NHEJ復(fù)合物組裝。

????????為了進(jìn)一步評估USP14在NHEJ修復(fù)中的作用，作者探究了S2056和T2609上DNA-PKcs自磷酸化的狀態(tài)，以及S1778上DNA-PKcs底物53BP1的狀態(tài)。在自噬缺陷細(xì)胞中，DNA-PKcs S2056、T2609 和53BP1S1778 IRIF的數(shù)量在IR后大大減少。然而，在IU1處理的自噬缺陷細(xì)胞中，DNA-PKcs 自磷酸化和53BP1 S1778 磷酸化依賴性IRIF在表達(dá)shATG7的LNCaP細(xì)胞中顯著恢復(fù)。

研究結(jié)論：USP14是DDR和NHEJ修復(fù)信號的重要調(diào)節(jié)劑。

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4.AKT調(diào)節(jié)USP14作為DDR效應(yīng)器的功能? ? ?

????????由于USP14的蛋白酶體活性受S432上USP14的Akt依賴性磷酸化調(diào)節(jié)，作者研究了AKT是否影響USP14的功能。作者實驗發(fā)現(xiàn)IR處理以時間依賴性方式誘導(dǎo)USP14病灶形成。此外，在IR處理后，表達(dá) shATG7的LNCaP細(xì)胞中USP14病灶的數(shù)量顯著增加。有趣的是，AKT的變構(gòu)藥物抑制劑MK2206顯著降低了shATG7表達(dá)細(xì)胞中的USP14 IRIF。此外，在自噬缺陷細(xì)胞中IR后0.5和24小時，DNA-PKcs S2056、DNAPKcs T2609、53BP1 S1778 和RIF1病灶顯著減少。另一方面，在MK2206處理的自噬缺陷細(xì)胞中，DNA-PKcs自磷酸化、53BP1 S1778磷酸化和RIF1病灶顯著恢復(fù)。總體而言，數(shù)據(jù)表明，Akt調(diào)節(jié)USP14的核功能，使其成為一個DDR效應(yīng)器。

????????為了探索PTEN在NHEJ修復(fù)中AKT介導(dǎo)的USP14磷酸化中的作用，作者在IR后通過USP14在VCaP (PTEN+) 與LnCaP (PTEN-) 細(xì)胞中檢測了IRIF。如預(yù)期所示，VCaP細(xì)胞未能形成核USP14 IRIF。

????????此外，正如預(yù)期的那樣，IR誘導(dǎo)的53BP1和DNA-PKcs S2056病灶的形成（PTEN-）LNCaP和C4-2自噬缺陷的細(xì)胞中減少，而在IU1處理的自噬缺陷的細(xì)胞中明顯恢復(fù)。相反，在（PTEN+）LnCaP和C4-2細(xì)胞中，自噬缺陷和USP14缺陷對IR誘導(dǎo)的53BP1或DNAPKcs S2056灶的形成都沒有任何明顯的影響。

研究結(jié)論：在自噬缺陷的細(xì)胞中， Akt調(diào)節(jié)USP14 IRIF和NHEJ DDR信號。

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5.USP14直接與Ku70相互作用并靶向其泛素化? ? ?

????????為了進(jìn)一步了解USP14的功能，作者通過質(zhì)譜法鑒定USP14相互作用蛋白。FLAG-HA標(biāo)記的USP14從C4-2細(xì)胞中瞬時表達(dá)和純化，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。除了與USP14共同純化的許多已知蛋白，作者在USP14相互作用蛋白中鑒定了幾種核心NHEJ蛋白。因為泛素化是 Ku70/80 從NHEJ后染色質(zhì)解離的關(guān)鍵翻譯后修飾，用于有效連接斷裂的DNA末端，作者探究USP14與Ku70和Ku80的相互作用。? ? ?

????????作者首先通過使用抗HA對來自共表達(dá) Flag-HAUSP14和 EGFP-Flag-Ku70 的HEK 293T細(xì)胞的USP14進(jìn)行IP來確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP14和 Ku70發(fā)生免疫共沉淀。作者進(jìn)一步通過對來自LNCaP細(xì)胞的USP14進(jìn)行IP，并對Ku70進(jìn)行免疫印跡，證實了內(nèi)源性Ku70和USP14之間的相互作用。? ? ?

????????作者接下來探究Ku70是否是USP14去泛素化的直接目標(biāo)。用IR處理轉(zhuǎn)染了His-Ub和Flag-Ku70的HEK 293T細(xì)胞。用抗Flag珠純化多泛素化的Ku70形式，并與重組人USP14孵化，進(jìn)行體外去泛素化試驗。在有USP14的情況下，Ku70的泛素化減少了。

????????作者還檢查了USP14是否使 Ku70 去泛素化并調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或其染色質(zhì)結(jié)合以響應(yīng) IR誘導(dǎo)的DNA DSB。IR處理后不同時間點Ku70水平的比較顯示shUSP14與shCtrl表達(dá)C4-2細(xì)胞沒有變化。然而，在IU1抑制USP14后，IR 治療后Ku70的染色質(zhì)募集增加。

研究結(jié)論：USP14可以調(diào)節(jié)Ku70/80復(fù)合物的染色質(zhì)募集，而不會顯著影響這些成分蛋白水平的表達(dá)。

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結(jié)論與討論

????????作者證明USP15調(diào)節(jié)HR和癌細(xì)胞對PARP抑制劑的反應(yīng)。從機制上講， USP15促進(jìn)了BARD1/BRCA1在DBS的保留，從而促進(jìn)了DSB末端的切除。因此， USP15對體內(nèi)的DNA損傷修復(fù)至關(guān)重要。此外，USP15C端在乳腺癌患者中發(fā)生突變，破壞了USP15-BARD1的相互作用，導(dǎo)致HR缺陷。因此，USP15加作為影響HR和PARP1抑制劑反應(yīng)的蛋白質(zhì)之一，對控制和調(diào)節(jié)DNA末端切除具有一定的作用。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkz1103