中文標(biāo)題：m6A去甲基化酶FTO通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖攝入和糖酵解減輕小鼠心臟功能障礙

研究對(duì)象：橫向主動(dòng)脈縮窄 (TAC)?處理的心力衰竭（HF）小鼠模型

組學(xué)技術(shù):?MeRIP-seq

?主要內(nèi)容?

2021年11月2日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科葛均波院士和孫愛(ài)軍教授為共同通訊在?Signal Transduction and Targeted Therapy?（IF=18.187）在線發(fā)表題為“m6A?demethylase FTO attenuates cardiac dysfunction by regulating glucose uptake and glycolysis in mice with pressure overload-induced heart failure”的論文，張倍健、蔣昊、吳劍為該文章共同第一作者。該研究在HF 小鼠模型中使用loss-of-function和gain-of-function方法系統(tǒng)探究了m6A去甲基化酶基因 FTO 在心臟代謝中的調(diào)節(jié)作用，首次報(bào)道了該基因在心臟功能發(fā)揮和結(jié)構(gòu)重塑中的關(guān)鍵功能，特別是作用于葡萄糖代謝途徑，揭示了m6A修飾在 HF 期間心臟代謝穩(wěn)態(tài)中作用，表明 FTO 有潛力成為 HF 預(yù)防和治療靶點(diǎn)。歐易生物在本研究中承擔(dān)了甲基化 RNA 免疫沉淀測(cè)序 (MeRIP-seq)?實(shí)驗(yàn)及分析工作。

?技術(shù)路線?

?研究背景?

N6-甲基腺苷 (m6A) 是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄后 mRNA最常見(jiàn)的修飾，參與多種生物過(guò)程和疾病。然而，其在心力衰竭 (HF) 期間心臟能量代謝變化中的作用仍然未知。該研究探討了m6A去甲基酶FTO在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的 HF 期間葡萄糖代謝中的作用。

?研究?jī)?nèi)容?

1.?TAC小鼠心臟組織m6A水平升高，在代謝特別是糖酵解相關(guān)基因中發(fā)生

甲基化 RNA 免疫沉淀測(cè)序 (MeRIP-seq) 用于繪制TAC小鼠心臟和對(duì)照心臟中轉(zhuǎn)錄組m6A修飾。TAC 中鑒定出的m6A峰的數(shù)量高于對(duì)照。與之前的報(bào)道一致，在 TAC 和對(duì)照心臟中，m6A峰在 3'-非翻譯區(qū)域富集，且m6A峰的序列特征符合典型的 RGAAR（R = A 或 G）motif規(guī)律。

a: 小鼠心臟組織檢測(cè)到的m6A peak數(shù)量

b: m6A peaks在全長(zhǎng)mRNA序列結(jié)構(gòu)中的分布

c: motif特征序列分析

GO分析顯示TAC 后的m6A變化不是隨機(jī)分布在整個(gè)基因組中，而是在某些 mRNA 類別中特異性增加，特別是在與代謝相關(guān)類別中。KEGG分析顯示糖酵解通路顯著富集，包括醛縮酶B（Aldob）、磷酸甘油酸變位酶2（Pgam2）、磷酸葡萄糖變位酶2（Pgm2）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（Tpi1）等5個(gè)糖酵解相關(guān)基因和二氫硫辛酰脫氫酶（Dld）。

d: GO富集分析顯示m6A集中分布代謝相關(guān)基因

e: KEGG富集結(jié)果表示糖酵解通路基因富集發(fā)生了m6A修飾

2. TAC小鼠中FTO基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，可能是驅(qū)動(dòng)m6A模式改變的關(guān)鍵

為了探索HF中m6A模式顯著改變的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因，對(duì)于m6A修飾酶相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。TAC處理后1、3和7天，m6A修飾相關(guān)酶基因表達(dá)幾乎沒(méi)有變化，但大多數(shù)m6A修飾酶基因表達(dá)水平在2周下降，在4周和8周進(jìn)一步下降，其中FTO mRNA表達(dá)下降最顯著，F(xiàn)TO蛋白表達(dá)水平也顯著降低；為了驗(yàn)證FTO表達(dá)水平在HF患者是否有相似的規(guī)律，本研究分析了來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)的 13 顆衰竭心臟和 15 顆未衰竭心臟 (GDS2206)的表達(dá)譜，結(jié)果表明HF 患者也表現(xiàn)出 FTO 表達(dá)下調(diào)。這些數(shù)據(jù)結(jié)果表明FTO的下調(diào)可能是TAC小鼠心臟m6A水平增加的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。

f: ?TAC小鼠術(shù)后8周FTO基因表達(dá)降低最為顯著

g: TAC小鼠術(shù)后8周 FTO蛋白表達(dá)水平顯著降低

3. Gain-of-function實(shí)驗(yàn)表明FTO過(guò)表達(dá)緩解TAC小鼠心臟功能障礙

為了明確 FTO 基因在HF 中的作用，通過(guò) AAV9病毒載體過(guò)表達(dá) FTO 進(jìn)行g(shù)ain-of-function實(shí)驗(yàn)。與 TAC 組相比，F(xiàn)TO 過(guò)表達(dá)顯著降低了 m6A水平，并且在 TAC 后 4 周和 8 周顯著減輕心臟功能障礙，左心室肥厚和擴(kuò)大癥狀有所改善，在第 8 周，與 TAC 小鼠相比，TAC+aavFTO 小鼠顯著改善了運(yùn)動(dòng)耐力。

j: HE, Masson, WGA三種方法對(duì)左心室進(jìn)行染色，Masson三色染色檢測(cè)纖維化。用WGA染色分析心肌肥厚

通過(guò)micro-PET/CT 在 TAC 小鼠中觀察到葡萄糖攝取顯著增加，TAC+aavFTO小鼠對(duì)18F-FDG的攝取進(jìn)一步增加，透射電鏡顯示FTO過(guò)表達(dá)改善TAC觀察到的線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，這些證據(jù)表明 FTO 過(guò)表達(dá)可改善 TAC 小鼠的心臟功能障礙。

k: 用micro-PET/CT對(duì)FTO過(guò)表達(dá)小鼠的心臟18F-FDG攝取成像。

h, i: 通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)量射血分?jǐn)?shù)EF和短軸縮短率FS表示左心室功能

4. Loss-of-function實(shí)驗(yàn)表明FTO敲降加劇TAC小鼠心臟功能障礙

FTO 敲降加劇了TAC小鼠心臟纖維化和心肌肥厚，并且降低葡萄糖攝取水平。透射電鏡觀察到TAC 小鼠的心肌細(xì)胞中線粒體基質(zhì)電子密度低，嵴紊亂，空泡形成，通過(guò) FTO 敲降后，這些線粒體進(jìn)一步加劇結(jié)構(gòu)紊亂。表明 FTO 敲降加劇了心臟功能障礙和結(jié)構(gòu)重塑以及心臟線粒體結(jié)構(gòu)變化，降低了心臟能量供應(yīng)。

S.a: 透射電鏡線粒體結(jié)構(gòu),3000×(上圖)，8000×(中圖)，15000?×(下圖)。

S.b: 線粒體數(shù)量受損的統(tǒng)計(jì)

5. 體外實(shí)驗(yàn)證明FTO敲降抑制心肌細(xì)胞糖酵解能力和ATP產(chǎn)生，進(jìn)而影響心肌收縮功能

為了進(jìn)一步評(píng)估 FTO 在體外環(huán)境的代謝調(diào)控作用，該研究在原代心肌細(xì)胞進(jìn)行FTO敲降和處理實(shí)驗(yàn)。在血管緊張素 II（Ang II）刺激模擬了TAC 小鼠模型中的FTO下調(diào)的表達(dá)模式。通過(guò)細(xì)胞外酸化率監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Ang II 刺激提高心肌細(xì)胞的糖酵解能力，而在該基礎(chǔ)上進(jìn)行FTO 敲降會(huì)顯著抑制糖酵解能力。FTO敲降導(dǎo)致的糖酵解能力抑制造成了ATP的生產(chǎn)障礙，可能直接影響心肌收縮功能；因此，F(xiàn)TO 敲降抑制了心肌細(xì)胞中 Ang II 刺激后的糖酵解能力和 ATP 產(chǎn)生，導(dǎo)致收縮功能障礙加重。

o: 用Seahorse XF Analyzer分析體外分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率(ECARs)

p: 糖酵解功能對(duì)比 ??????q: ATP產(chǎn)量對(duì)比

6. FTO作用于葡糖糖攝入和糖酵解過(guò)程機(jī)制探討

KEGG 分析顯示，TAC 小鼠心臟中有五個(gè)糖酵解相關(guān)基因的 m6A發(fā)生了改變，為了探究這些基因 m6A模式改變是否影響蛋白表達(dá)水平，在 FTO 敲降的 TAC 小鼠中檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 只有Pgam2 蛋白水平顯著降低，MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了FTO敲降進(jìn)一步上調(diào)了Pgam2的甲基化水平；為了探究Pgam2的表達(dá)水平和m6A修飾是如何被FTO所調(diào)控，進(jìn)行了RNA pull-down assay實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FTO與生物素標(biāo)記的Pgam2 mRNA結(jié)合，通過(guò)mRNA lifetime assays表明FTO敲降加速了Pgam2的mRNA降解速率。這提示了去甲基化酶FTO結(jié)合Pgam2 mRNA分子改變m6A修飾，影響其分子穩(wěn)定性，進(jìn)而影響蛋白水平和糖酵解途徑中的功能發(fā)揮。

r：m6A發(fā)生改變的5個(gè)糖酵解相關(guān)基因

s：5個(gè)糖酵解相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平

t：MeRIP-qPCR檢測(cè)Pgam2 m6A水平

u：監(jiān)測(cè)Pgam2 mRNA在原代心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄抑制處理后的降解速率

為了進(jìn)一步探究FTO影響心肌細(xì)胞葡萄糖攝入量的原因，作者分別對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系列基因的m6A水平和基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，MeRIP-seq 顯示葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (GLUT) 蛋白相關(guān)基因的m6A修飾沒(méi)有任何變化，但FTO 敲低降低了 TAC 小鼠 Glut4轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，且 GLUT4 和磷酸化 AKT（p-AKT）蛋白水平顯著下調(diào)；此外，PGAM2、GLUT4 和 p-AKT 的表達(dá)水平在 FTO 過(guò)表達(dá)后上調(diào)，這些數(shù)據(jù)提示 FTO 可能通過(guò)調(diào)節(jié) AKT-GLUT4 軸來(lái)調(diào)節(jié)葡萄糖攝取。

??

v: FTO敲低下調(diào)GULT2、p-Akt、Akt蛋白水平

a~d: FTO過(guò)表達(dá)上調(diào)PGAM2，激活A(yù)KT-GLUT4軸基因表達(dá)

?文章小結(jié)?

該研究在HF 小鼠模型中使用loss-of-function和gain-of-function方法系統(tǒng)探究了m6A去甲基化酶基因 FTO 在心臟代謝中的調(diào)節(jié)作用，首次報(bào)道了該基因在心臟功能發(fā)揮和結(jié)構(gòu)重塑中的關(guān)鍵功能，特別是作用于葡萄糖代謝途徑，揭示了m6A修飾在 HF 期間心臟代謝穩(wěn)態(tài)中作用，表明 FTO 有潛力成為 HF 預(yù)防和治療靶點(diǎn)。

FTO調(diào)節(jié)葡萄糖攝取和糖酵解的理論模型

?專業(yè)術(shù)語(yǔ)?

1.?肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)：N6-甲基腺苷(m6A)去甲基酶，以往的研究證實(shí)FTO可通過(guò)3’非翻譯區(qū)域調(diào)節(jié)下游的m6A水平來(lái)影響肥胖。隨著研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)m6A甲基化這一表觀遺傳修飾能通過(guò)調(diào)控腫瘤基因、抑腫瘤基因的mRNA分子的表達(dá)水平調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2.?主動(dòng)脈弓縮窄（Transverse aortic constriction, TAC)模型：是一個(gè)慢性心室肥大的最為常用疾病模型，可用于模擬高血壓或室內(nèi)壓增高而引起的肥厚性心肌病，在臨床前藥物研究或基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。TAC手術(shù)后即刻誘發(fā)/啟動(dòng)心室肥厚的進(jìn)程。

3.?Angiotensin II?：一種血管收縮劑，是腎素/血管緊張素系統(tǒng)的主要生物活性肽。Angiotensin II human 在調(diào)節(jié)人類血壓中起著核心作用， 刺激交感神經(jīng)刺激，增加醛固酮生物合成和腎臟活動(dòng)。

4.?Extracellular Acidification Rate （產(chǎn)酸率，ECAR）：糖解作用所產(chǎn)生的丙酮酸（pyruvate）經(jīng)過(guò)actate dehydrogenasw 反應(yīng)產(chǎn)生乳酸（lactate），允許細(xì)胞在不消耗氧氣的情況下快速產(chǎn)生ATP以滿足能量需求，測(cè)量乳酸的氫離子可以說(shuō)明無(wú)氧代謝的變化。

5.?Seahorse?XF?分析儀：測(cè)量多孔板中活細(xì)胞的耗氧率 (OCR) 和細(xì)胞外酸化率 (ECAR),以研究關(guān)鍵細(xì)胞功能,例如線粒體呼吸和糖酵解。

6.?18F-FDG：18氟代脫氧葡萄糖，影像學(xué)檢查PET/CT最常用的顯像劑

7.?micro-PET/CT：小動(dòng)物PET/CT成像系統(tǒng)

8.?masson染色：顯示膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色；

9.?WGA染色：主要染細(xì)胞膜，呈現(xiàn)綠色；

10.?MeRIP-qPCR：MeRIP實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行一個(gè)qPCR，目的是驗(yàn)證某個(gè)目標(biāo)基因上的某個(gè)修飾位點(diǎn)（以一小段區(qū)域的形式，MeRIP法精確不到單堿基）的修飾水平。

11.?RNA pull-down：檢測(cè)與目的RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離；復(fù)合物洗脫后，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。

12.?Oligomycin：是一種ATP synthase抑制劑，作用于線粒體膜的耦合過(guò)程，抑制氧化磷酸化和所有ATP依賴性反應(yīng)

?原文鏈接?

https://doi.org/10.1038/s41392-021-00699-w

END

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