細(xì)胞周期（cell cycle）是指從細(xì)胞分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞生長開始，到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的時間，代表生命從一代向下一代傳遞的連續(xù)過程。在這一過程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個子細(xì)胞。

細(xì)胞周期主要分為：DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和細(xì)胞分裂期（M期）。G1期主要合成RNA和核糖體，細(xì)胞體積明顯增大。S期除了合成DNA外，還要合成組蛋白以及DNA復(fù)制所需的酶。G2期是有絲分裂的準(zhǔn)備期，DNA合成終止，大量合成RNA包括微管蛋白和促成熟因子等。M期細(xì)胞分裂，DNA由二倍體重新成為一倍體。

細(xì)胞周期的檢測方法

測定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞儀法、基于細(xì)胞成像的熒光檢測法等。

1 .?同位素標(biāo)記法

標(biāo)記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細(xì)胞周期時間的方法。其原理是對測定細(xì)胞進行脈沖標(biāo)記、定時取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期。

檢測原理：① 待測細(xì)胞經(jīng) 3H- 胸腺嘧啶核苷標(biāo)記后，所有 S 期細(xì)胞均被標(biāo)記。
② S 期細(xì)胞經(jīng) G2 期才進入 M 期，所以一段時間內(nèi) PLM = 0。
③ 開始出現(xiàn)標(biāo)記 M 期細(xì)胞時，表示處于 S 期最后階段的細(xì)胞，已渡過 G2 期，所以從 PLM = 0 到出現(xiàn) PLM 的時間間隔為 G2期的持續(xù)時間。
④ S 期細(xì)胞逐漸進入 M 期，PLM 上升，到達到最高點的時候說明來自處于 S 最后階段的細(xì)胞，已完成 M，進入 G1 期。所以從開始出現(xiàn) M 到 PLM 達到最高點 (≈ 100%) 的時間間隔就是 M 期的持續(xù)時間。
⑤ 當(dāng) PLM 開始下降時，表明處于 S 期最初階段的細(xì)胞也已進入 M 期，所以出現(xiàn) LM 到 PLM 又開始下降的一段時間等于 S 期的持續(xù)時間。

2 .流式細(xì)胞儀 PI 染色法

細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 期 )。

檢測原理：

由于細(xì)胞周期各時相的 DNA 含量不同，通常正常細(xì)胞的 G1 / G0 期具有二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結(jié)合，其熒光強度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀 PI 染色法對細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進行檢測時，可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細(xì)胞百分率。

流式細(xì)胞周期檢測注意事項：

①?建議選擇6孔板操作，細(xì)胞給藥密度在60%左右，但如果收樣時，孔內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)明顯觀察到細(xì)胞漂浮凋亡，那對流式檢測的結(jié)果會有很大的影響。流式細(xì)胞術(shù)收樣時，盡量保證孔內(nèi)細(xì)胞還未漂浮。

②?收樣時，如果孔內(nèi)已經(jīng)有細(xì)胞漂浮，細(xì)胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化，消化時間必須嚴(yán)格控制，及時終止消化，消化時間太久，容易對細(xì)胞造成損傷和死亡。

③?收集細(xì)胞時，離心機選用4℃，350×g離心5分鐘，小心吸去上清。加入1mL預(yù)冷的PBS，用手指將管內(nèi)的細(xì)胞彈勻，再加入3 mL預(yù)冷的3 ml無水乙醇(-20℃預(yù)冷)中，邊加邊高速攪拌。-20℃固定過夜。整個收樣過程中，不要用槍頭吹打細(xì)胞，一是會損傷細(xì)胞，二是造成細(xì)胞損失。

④?進行實驗時，首先4℃，350×g離心5分鐘，棄去乙醇溶液此時格外需要注意的是，離心后細(xì)胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會存在大量細(xì)胞，去上清一定要注意。加入周期試劑盒的染色液，避光染色30分鐘以上，上機測試前最好使用200目篩網(wǎng)過篩，以免細(xì)胞聚集堵塞機器管道。

3.?基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒別細(xì)胞處在細(xì)胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細(xì)胞周期的進程。FUCCI 技術(shù)建立在鑒定過表達的兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是綠色熒光基團 AmCyan，而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平隨著細(xì)胞周期的變化而不斷波動：Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達 FUCCI 細(xì)胞核在G1 期為紅色而在 S，G2 和 M 期則呈現(xiàn)綠色。

檢測方法：

A375S FUCCI 球體準(zhǔn)備的方法如下：Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含有 EGF (20 ng / mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培養(yǎng)基，按每孔 1,000 細(xì)胞進行種板。細(xì)胞板離心 (800 g,6 min) 后在 37 ℃，5% CO2條件下進行孵育。最后，用含 10% FCS 的培養(yǎng)基清洗球體 3 次以移除 EGF 和 B27，繼續(xù)培養(yǎng) 1 至 6 天。

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