抗體或重組蛋白DS和DP生產(chǎn)過(guò)程中形成蛋白顆粒的現(xiàn)象已被廣泛報(bào)道，如超濾洗濾導(dǎo)致蛋白溶液濁度升高、旋轉(zhuǎn)柱塞泵灌裝帶來(lái)的亞可見(jiàn)微粒(SvP)，以及注射器內(nèi)層硅油脫落導(dǎo)致的蛋白聚集和SvP等。

考慮到蛋白質(zhì)顆粒可能引發(fā)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)法規(guī)對(duì)注射液中10 μm及以上微粒的含量提出了嚴(yán)格要求（≥10 μm和≥25 μm的SvP限值分別為6000粒/支和600粒/支）。雖然法規(guī)尚未對(duì)＜10 μm的SvP含量提出監(jiān)管要求，但是考慮到無(wú)法有效過(guò)濾的納米微?？赡茏鳛槌珊似鹗键c(diǎn)進(jìn)一步聚集，潛在影響產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)的安全性和有效性。因此生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)盡量避免顆粒生成并嚴(yán)格控制顆粒數(shù)量。

蛋白質(zhì)顆粒本質(zhì)上是蛋白分子聚集而成，包含數(shù)千到數(shù)百萬(wàn)個(gè)單體分子。蛋白質(zhì)聚集可概要為“成核”和“聚集體生長(zhǎng)”兩個(gè)階段。首先是蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致形成二聚體或寡聚體的核心，隨后聚集體生長(zhǎng)，最終形成亞可見(jiàn)或可見(jiàn)的蛋白顆粒。

生產(chǎn)過(guò)程中蛋白分子會(huì)暴露于多重應(yīng)力下，包括界面應(yīng)力、機(jī)械剪切、空化、外來(lái)納米顆粒、熱應(yīng)力等，這是導(dǎo)致蛋白質(zhì)顆粒形成的主要原因。結(jié)合現(xiàn)有研究進(jìn)展，簡(jiǎn)要介紹不同應(yīng)力介導(dǎo)顆粒生成的原因。

一、界面應(yīng)力

界面應(yīng)力主要包括氣液界面應(yīng)力和液固界面應(yīng)力，二者普遍存在于DS和DP工藝操作中。針對(duì)界面應(yīng)力介導(dǎo)的顆粒生成原因，普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)在這些相邊界上吸附和富集導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，形成聚集體、蛋白團(tuán)簇或者蛋白膜，然后在機(jī)械作用（攪拌、泵送、拉伸等）下使聚集體、蛋白團(tuán)簇或蛋白膜碎片進(jìn)入主體溶液，進(jìn)一步生長(zhǎng)形成蛋白顆粒。所以，蛋白質(zhì)聚集（成核）可能是在界面應(yīng)力作用下開(kāi)始的，但界面應(yīng)力本身似乎不足以促進(jìn)蛋白質(zhì)顆粒的形成，需要在機(jī)械應(yīng)力的協(xié)同作用下促進(jìn)“核”進(jìn)入蛋白溶液并不斷在界面形成新的“核”，蛋白溶液中的“核”進(jìn)一步聚集形成蛋白顆粒。

固體材料直接影響液固界面應(yīng)力介導(dǎo)的蛋白顆粒形成，例如TFF過(guò)程中使用親水性共聚物改性的管路能夠減少蛋白質(zhì)顆粒的形成并提高通量，不銹鋼表面和氧化鋁表面誘導(dǎo)的SvP顯著不同。這些研究為DS和DP生產(chǎn)過(guò)程中耗材和設(shè)備的選擇與提供了參考。

對(duì)于涉及界面應(yīng)力的顆粒形成，在蛋白溶液中加入表面活性劑（PS80或PS20）可以有效抑制聚集和顆粒的形成。表面活性劑通過(guò)與蛋白分子在空氣-溶液界面上競(jìng)爭(zhēng)，或是在液固界面優(yōu)先吸附從而起作用。

二、液壓/機(jī)械剪切應(yīng)力

攪拌過(guò)程中的機(jī)械剪切應(yīng)力是蛋白質(zhì)聚集的常見(jiàn)原因。剪切應(yīng)力及其與界面應(yīng)力的結(jié)合已被廣泛研究多年。剪切應(yīng)力介導(dǎo)的蛋白顆粒形成與產(chǎn)品對(duì)其敏感性高度相關(guān)，對(duì)于穩(wěn)定性良好的蛋白來(lái)說(shuō)，如果不涉及界面應(yīng)力，僅高剪切應(yīng)力似乎不足以使蛋白質(zhì)聚集。例如一項(xiàng)對(duì)不同的蛋白質(zhì)給予1.6x106 s-1的平均剪切速率(比生物加工中預(yù)期的剪切速率大3-5個(gè)數(shù)量級(jí))研究中，測(cè)試的蛋白質(zhì)均未顯示聚集增加。單純的高剪切力可能不足以使蛋白構(gòu)象發(fā)生變化形成“核心”，但是高剪切力可以加劇氣液或液固界面效應(yīng)，以促進(jìn)“核”的生成和其在蛋白溶液中的流通，進(jìn)而加速聚集體生長(zhǎng)。因此，蛋白顆粒的形成是機(jī)械應(yīng)力和界面應(yīng)力的疊加效果。由于實(shí)際生產(chǎn)中機(jī)械應(yīng)力與界面應(yīng)力通常共存，所以無(wú)法準(zhǔn)確驗(yàn)證哪種應(yīng)力對(duì)蛋白顆粒形成的貢獻(xiàn)更大，但是二者都被認(rèn)為是顆粒形成的必要條件。此外，實(shí)際生產(chǎn)中，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)械參數(shù)降低機(jī)械剪切力以緩解蛋白聚集是最常用和最易實(shí)現(xiàn)的操作方法。

三、空化

流體動(dòng)力空化是一種獨(dú)特的流體動(dòng)力現(xiàn)象，由于壓力變化而在液體中形成氣腔(常見(jiàn)于湍流中)。突然的壓力下降會(huì)導(dǎo)致空腔(氣泡)的形成，當(dāng)暴露在高壓下時(shí)，這些空腔(氣泡)會(huì)迅速內(nèi)爆。這種連續(xù)的空腔形成和塌陷會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊并導(dǎo)致局部短暫的高溫高壓，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)去折疊發(fā)生聚集，或形成自由基攻擊蛋白質(zhì)導(dǎo)致共價(jià)聚集發(fā)生。有報(bào)道稱(chēng)顯示，僅僅從10英寸的高度將含有兩種單抗液體制劑的小瓶掉在地板上就會(huì)引起機(jī)械沖擊(空化)，從而引起蛋白質(zhì)顆粒的生成?？栈^(guò)程中可以產(chǎn)生羥基自由基，而羥基自由基可促進(jìn)蛋白質(zhì)的交聯(lián)，并隨之增加亞可見(jiàn)微粒。此外，空化會(huì)導(dǎo)致蛋白分子暴露在更多氣液界面應(yīng)力下。因此，空化作用導(dǎo)致的蛋白聚集和顆粒形成可以理解為機(jī)械應(yīng)力，化學(xué)應(yīng)力和氣液界面應(yīng)力的綜合作用結(jié)果。

四、外來(lái)納米顆粒成核

兩個(gè)固體表面的研磨/磨損會(huì)使外來(lái)顆粒脫落到藥物溶液中。一個(gè)廣泛報(bào)道的例子是旋轉(zhuǎn)柱塞泵，其中活塞和外殼的接觸導(dǎo)致不銹鋼納米顆粒脫落，這些外來(lái)顆粒可能作為蛋白質(zhì)顆粒形成的成核啟動(dòng)位點(diǎn)，省略了前期蛋白質(zhì)聚集成核的過(guò)程，根據(jù)非均相成核理論，蛋白質(zhì)進(jìn)一步聚集并形成顆粒。另一種成核理論是由液固界面應(yīng)力介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子吸附到固體表面，界面應(yīng)力導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集體從固體表面解吸附，通過(guò)混合湍流回到蛋白質(zhì)溶液中，作為“核心”促進(jìn)微粒的進(jìn)一步生長(zhǎng)和形成。此時(shí)，固體表面積和湍流程度是實(shí)現(xiàn)這一機(jī)制的主要因素。因此，外來(lái)顆粒既可以作為“核心”又可以增加界面應(yīng)力，二者協(xié)同作用促進(jìn)蛋白顆粒形成。

五、熱應(yīng)力

兩個(gè)固體之間摩擦/研磨產(chǎn)生的熱量可能導(dǎo)致局部溫度升高帶來(lái)熱應(yīng)力。加熱過(guò)程源于接觸面上層的原子層之間的相互作用，摩擦加熱導(dǎo)致的接觸面升溫足以導(dǎo)致接觸面上蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。但是這種熱能很難測(cè)量，因?yàn)樗某志糜绊懯嵌虝旱模覙O其局限。目前針對(duì)溫度檢測(cè)的方法（如紅外探測(cè)）主要在宏觀水平，而不是在受研磨影響的微觀體積上，此外，液體溶液可以快速淬滅混合過(guò)程中產(chǎn)生的熱量，導(dǎo)致無(wú)法探測(cè)瞬態(tài)熱量。因此，測(cè)量和報(bào)告的溫度無(wú)法代表蛋白質(zhì)所經(jīng)歷的真實(shí)溫度，實(shí)際摩擦點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)可能會(huì)經(jīng)歷極短時(shí)間(如<1 ms)的極端高溫并導(dǎo)致降解，這種降解在大表面高頻磨削下可能尤其明顯。該理論在小型攪拌棒研究和大規(guī)?；旌涎芯恐卸嫉玫搅酥С?，即增加接觸表面積、速度或混合時(shí)間導(dǎo)致SvP增加。在一項(xiàng)針對(duì)某些類(lèi)型的底置攪拌器混合操作時(shí)蛋白顆粒形成的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)子(葉輪)和定子(驅(qū)動(dòng)單元)2個(gè)軸承之間的磨削是誘導(dǎo)顆粒形成的條件，并傾向歸因于局部熱效應(yīng)。

小結(jié)

蛋白聚集和顆粒形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，既與蛋白分子本身穩(wěn)定性直接相關(guān)，又受工藝參數(shù)和操作的直接影響。生產(chǎn)中使用的不同耗材以及混勻攪拌等操作勢(shì)必會(huì)將蛋白質(zhì)分子暴露在不同應(yīng)力下，而且不同應(yīng)力通常共存在同一工藝過(guò)程中，比如蠕動(dòng)泵送過(guò)程涉及界面、機(jī)械、納米顆粒和熱效應(yīng)等多重應(yīng)力。所以，現(xiàn)階段蛋白顆粒的形成通常被認(rèn)為是多重應(yīng)力共同的作用結(jié)果。隨著研究的不斷深入，蛋白聚集和顆粒形成的機(jī)制將被闡釋的更加清楚，也會(huì)給生產(chǎn)工藝的優(yōu)化帶來(lái)更多參考和啟發(fā)。

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