大腸桿菌是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大量腹瀉病例的一種重要的病原體，生物還原劑替拉帕扎明（TPZ）在臨床上用于治療各種類型的癌癥，也對大腸桿菌菌株具有明顯的抗菌活性。TPZ通過調(diào)節(jié)耐藥性相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)了大腸桿菌耐藥性的逆轉(zhuǎn)，這可能在耐藥性細(xì)菌感染的臨床治療中具有輔助作用。近日，北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院在傳染病學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域期刊《International Journal of Antimicrobial Agents》（IF= 10.8，JCR Q1）上發(fā)表了題為《New insights into the antimicrobial action and protective therapeutic effect of tirapazamine towards Escherichia coli-infected mice》的研究成果，旨在評估TPZ對大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)性治療作用，并深入了解其抗菌作用機(jī)制。

奧維森科技在研究中提供了腸道微生物組學(xué)和大腸桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)測序及分析服務(wù)，下面就讓小編帶大家一起來看看這篇文章吧！

替拉帕扎明對大腸桿菌感染小鼠的抗菌作用和保護(hù)性治療作用的新見解

合作單位

北京農(nóng)學(xué)院

研究背景

大腸桿菌是人類和動物常見的腸道微生物，也是第五常見的主要食源性病原體，可導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道疾病?？股氐倪^度使用和濫用加速了抗生素耐藥性細(xì)菌的傳播，多重耐藥（MDR）菌的增加已成為全球公共衛(wèi)生的主要威脅，且耐藥（AMR）菌株可以在環(huán)境、動物和人中廣泛傳播，從而對感染疾病控制構(gòu)成挑戰(zhàn)。替拉帕扎明（TPZ）是一種雜環(huán)二氮氧化物，是一種生物還原劑，可通過誘導(dǎo)DNA和染色體斷裂導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，同時也具有殺菌作用，且在厭氧條件下更具活性。此外，也有研究報導(dǎo)過TPZ對MDR菌株的抗菌活性。

本研究旨在通過體外抗菌活性、耐藥性逆轉(zhuǎn)、生物膜形成和蛋白質(zhì)組學(xué)分析來深入了解TPZ的抗菌作用機(jī)制，并通過觀察臨床癥狀、組織細(xì)菌負(fù)荷、組織病理學(xué)特征和腸道微生物群變化來評估TPZ對大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)性治療作用，了解TPZ作為一種潛在的單一或聯(lián)合抗菌劑治療病原體感染的有效性和安全性。

樣本采集與處理

將50 mL大腸桿菌懸浮液用TPZ的一半最小抑菌濃度（MIC）激發(fā)6小時作為處理組（ET），使用另外50 mL的大腸桿菌懸浮液作為未處理的對照組（EC）。采集ET和EC細(xì)胞并在-80 °C下儲存，在timsTOF Pro質(zhì)譜儀上進(jìn)行4D Label-Free檢測用于蛋白質(zhì)組分析。

5周齡雌性BALB/c小鼠，被適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，并被隨機(jī)分為三組：對照組（C）、大腸桿菌感染組（E）和大腸桿菌感染+TPZ治療組（ET）。大腸桿菌激發(fā)試驗通過腹膜內(nèi)注射5.0×106CFU/小鼠的劑量進(jìn)行，感染當(dāng)天被視為第0天。感染后3天，治療組小鼠通過腹膜內(nèi)注射25 mg/kg劑量的TPZ，每天兩次，持續(xù)7天，大腸桿菌感染組注射不含TPZ的溶劑。在感染后11天從每組收集新鮮的小鼠糞便用于擴(kuò)增子測序以分析糞便微生物群。

測序區(qū)域和平臺

微生物組?16S rRNA V3-V4區(qū)；Illumina Miseq PE300。

蛋白質(zhì)組?4D Label-Free；timsTOF Pro質(zhì)譜儀

研究成果
1、TPZ對大腸桿菌的體外抗菌活性和細(xì)胞活力

測定了TPZ對大腸桿菌E和E-10菌株的MIC均為25 μM，在50 μM和更高濃度的TPZ下，兩種大腸桿菌菌株的生長都被完全抑制。TPZ對兩株大腸桿菌的最小殺菌濃度（MBC）均為50μM，表明TPZ對大腸桿菌具有較強(qiáng)的抗菌活性。

HD11細(xì)胞的TPZ的半數(shù)毒性濃度（CC50）值為37.97 μM，Vero細(xì)胞的TPZ的CC50值為593.5 μM，表明TPZ在較高濃度下對細(xì)胞具有潛在的毒性。TPZ對Vero細(xì)胞的CC50值是MBC值的10倍，說明制定合理的藥物劑量和程序可以有效防止復(fù)合物對細(xì)胞活力的損害。

2、TPZ逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性表型

兩種大腸桿菌菌株都是MDR菌，經(jīng)TPZ處理后各類耐藥性已從中度敏感降至敏感，TPZ影響大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、多肽類、酰胺醇類和四環(huán)素類抗生素的耐藥性。TPZ對大腸桿菌具有強(qiáng)效的抗生物膜能力，并可能解釋耐藥性表型的逆轉(zhuǎn)。

3、TPZ誘導(dǎo)的差異表達(dá)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

使用4D Label-Free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了TPZ對大腸桿菌中蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，在EC和ET組中鑒定出2218種蛋白質(zhì)，分別有53和47種蛋白質(zhì)上調(diào)或下調(diào)。

4、蛋白質(zhì)GO和代謝通路分析

TPZ處理后，大腸桿菌色氨酸代謝、過氧化氫酶、牛磺酸與下丘腦代謝相關(guān)蛋白顯著上調(diào)。色氨酸在腸道免疫耐受和維持腸道微生物組平衡方面發(fā)揮著重要作用。此外，DNA損傷、修復(fù)和重組相關(guān)蛋白RecA、Holliday連接ATP依賴性DNA解旋酶RuvB、tRNA假尿苷合成B、DNA回旋酶B亞基和原體蛋白I也顯著上調(diào)。保護(hù)細(xì)菌免受活性氧自由基（ROS）引起的氧化應(yīng)激的蛋白質(zhì)顯著下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝中氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞，主要涉及免疫系統(tǒng)中的過氧化氫酶、抗氧化劑、雙功能過氧化氫酶和硫氧化還原蛋白/谷胱甘肽過氧化物酶BtuE。

5、TPZ在大腸桿菌感染的小鼠模型中顯示出潛在的療效

與未治療組相比，TPZ治療顯著減輕了大腸桿菌感染誘導(dǎo)的體重減輕、死亡率、結(jié)腸炎，還提高了小鼠的存活率。TPZ治療后7天，小鼠體內(nèi)細(xì)菌載量急劇減少，幾乎所有的細(xì)菌都被從體內(nèi)清除。組織學(xué)分析顯示，TPZ治療小鼠腺體結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤顯著減弱。結(jié)果表明，在小鼠感染模型中TPZ有效地改善了感染癥狀、結(jié)腸炎和細(xì)菌定植。

6、TPZ治療誘導(dǎo)小鼠腸道微生物群變化

與C組比較，E組和ET組的腸道微生物群多樣性呈下降趨勢。主成分分析顯示，ET組的微生物群落組成與E組和C組截然不同，表明TPZ處理在一定程度上影響了小鼠的微生物群落構(gòu)成。γ-變形菌、放線菌和彎曲桿菌是糞便微生物群中的主要門。

LEfSe分析顯示E組中Helicobacter、Helicobacterbilis和Lachnospiraceae含量豐富，ET組中Turicimonasmuris，bacterium_Ellin5012和Lactobacillus?acidophilus豐度增加。KEGG分析顯示，C、E和ET組的差異表達(dá)蛋白在ET中顯著富集。大腸桿菌感染和TPZ治療強(qiáng)烈影響了小鼠的腸道微生物組結(jié)構(gòu)，特別是關(guān)于Bacterium_Ellin5012，Bacterium，Bifidobacteriumsp，Staphylococcusequorum，uncultured Corynebacterium和Lachnospiraceae。

研究結(jié)論

1、TPZ在體外和體內(nèi)均能有效抑制大腸桿菌的增殖。

2、TPZ的耐藥性逆轉(zhuǎn)活性是通過調(diào)節(jié)與大腸桿菌耐藥性和生物膜形成相關(guān)的基因來實現(xiàn)的。

3、蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，TPZ對大腸桿菌的抗菌活性可能是通過破壞細(xì)菌DNA來實現(xiàn)的。

4、TPZ提高了大腸桿菌感染小鼠的存活率，TPZ對小鼠的保護(hù)性治療作用也可能與腸道微生物群的調(diào)節(jié)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

Zhouhui W, Yu W, Lei L, etl. New insights into the antimicrobial action and protective therapeutic effect of tirapazamine towards Escherichia coli-infected mice[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2023.