研究背景

微囊藻毒素（MCs）經(jīng)常在全球富營養(yǎng)到超營養(yǎng)的湖泊、池塘和河流中發(fā)現(xiàn)。近年來，嚴重藍藻藻華出現(xiàn)的頻率和強度有所增加。微囊藻毒素-lr（MC-LR）是MCs的一種主要毒性形式，因其很強的毒性和廣泛的分布而廣受關(guān)注。在藍藻水華期間，MC-LR的濃度往往超過了世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定量。人的身體接觸MC-LR污染的食物會伴隨微粒吸入，從而影響健康。因此，高濃度的MC-LR對公共衛(wèi)生的影響不容忽視。

2023年1月，東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室劉冉課題組在（IF：9.988）上發(fā)表了題為的研究成果，該研究通過TMT標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析MC-LR處理的和未受處理的SGC-7901細胞的蛋白和磷酸化的差異，并通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)雌激素信號通路可能是其影響細胞的關(guān)鍵通路。

中文標題：綜合蛋白質(zhì)組學(xué)和磷蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，微囊藻毒素- lr通過雌激素潛能參與胃癌的惡性進展

研究對象：SGC-7901細胞

發(fā)表期刊：Environmental Pollution

影響因子：9.988

發(fā)表時間：2023年1月15日

運用組學(xué)技術(shù)：TMT標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白組學(xué)

研究背景

有研究表明，長期暴露于MC-LR可能導(dǎo)致前列腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌，它被國際癌癥研究機構(gòu)視為潛在的人類致癌物。然而，胃作為重要的消化器官，MC-LR對胃癌（GC）進展的影響尚不清楚。該研究旨在使用組學(xué)的方式確定MC-LR對胃癌進展的影響及相關(guān)分子機制。

研究思路

研究結(jié)果

1.?MC-LR可促進SGC-7901細胞的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡

為了確定MC-LR在體外觸發(fā)胃癌細胞作用的最佳濃度，使用6種濃度MC-LR處理SGC-7901細胞（胃腺癌細胞）24 h。通過細胞活力、凋亡細胞數(shù)量、遷移水平和侵襲水平分析，最終確認100 nM的MC-LR適合用于胃癌的進一步研究（圖1）。

圖1 | MC-LR對胃癌惡性進展的影響

2.?SGC-7901細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析

為了進一步分析MC-LR誘導(dǎo)SGC-7901細胞的反應(yīng)，并探索相關(guān)的通路，研究者進行了TMT標記蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了蛋白質(zhì)的豐度和磷酸化狀態(tài)的變化。主成分分析（PCA）顯示MC-LR處理組和未處理組之間有明顯的分離（圖2B和C）。TMT蛋白組學(xué)鑒定出來自6320個蛋白的48109條特異性肽段。修飾化蛋白組學(xué)鑒定出來自1375磷酸化蛋白的3218個特異的磷酸肽（圖2D）。蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)共同鑒定出1231個蛋白（圖2E）。

圖2 |?mc-lr誘導(dǎo)的SGC-7901蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組

3.在SGC-7901細胞中的蛋白質(zhì)表達分析揭示了MC-LR誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)組圖譜

MC-LR處理的細胞和對照組相比，共鑒定出22個差異表達蛋白（DEPs），其中有7個上調(diào)蛋白（YIF1A、KDELR1、HIKESHI、CCNE1、CCDC9、KRT16和C12orf29）及15個下調(diào)蛋白（BUD13、HRNR、RCOR3、SYNRG、KRT1、GOLGA5、DCD、KRT10、KRT9、SLC26A6、KIAA0319L、MRPS24、ZNF207、TNFRSF12A和DNAJB14）（圖3B）。為了研究由MC-LR引起的病理相關(guān)的生物學(xué)過程，對差異蛋白進行GO和KEGG富集分析。DEPs主要參與甲酸轉(zhuǎn)運、甘露醇轉(zhuǎn)運、RES復(fù)合物、細胞包膜和無機陰離子交換活性（圖3C）。在KEGG通路分析結(jié)果中，DEPs參與了細胞因子-細胞因子受體相互作用、礦物質(zhì)吸收、雌激素信號通路和胃癌等通路（圖3D）。

圖3 | 差異蛋白分析

4.蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，雌激素信號通路可能在MC-LR處理細胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用

其它研究表明，蛋白磷酸酶PP1和PP2A是MC-LR促進癌癥的關(guān)鍵靶點。為了進一步探索MC-LR處理的蛋白磷酸化和去磷酸化控制的信號通路，進行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，磷酸化蛋白質(zhì)分離成兩個簇，共178條差異磷酸化肽段對應(yīng)87個蛋白（圖4A和B）。分析所有修飾位點的分布情況發(fā)現(xiàn)，有60.11%的蛋白質(zhì)分有多個修飾位點（位點≥2，圖4D）。

GO分析結(jié)果顯示，DEPPs主要參與RNA剪接、mRNA加工、核漿、核斑點、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性和Poly (A) RNA結(jié)合等條目（圖4E）。KEGG通路分析結(jié)果顯示，DEPPs主要富集于抗原加工和呈遞、雌激素信號通路、IL-17信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和MAPK信號通路（圖4F）。有趣的是，蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組中KEGG富集前20條通路中共富集到雌激素信號通路，該通路可能在MC-LR觸發(fā)的胃癌進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖4G）。

圖4 |?蛋白質(zhì)磷酸化表達分析揭示了MC-LR觸發(fā)的磷酸化蛋白質(zhì)組譜

5.MC-LR損害Hsp90的磷酸化，導(dǎo)致激活的ERα從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核

使用Motif-X來分析這些磷酸化位點位置的特異性頻率，蛋白質(zhì)激酶傾向于使一個特定的基序磷酸化。因此，通過磷酸化位點獲得的三個氨基酸序列可以為磷酸化蛋白的分類和預(yù)測其信號通路提供有用的信息（圖5 A）。根據(jù)蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組結(jié)果，在雌激素信號通路中發(fā)現(xiàn)，在MC-LR處理的SGC-7901細胞中，Krt16蛋白表達升高，Hsp90磷酸化水平降低（圖5 B）。為了研究MC-LR是否參與了ERα從細胞質(zhì)進入細胞核的過程，作者分析了細胞質(zhì)和核提取物中ERα的水平。結(jié)果顯示，經(jīng)MC-LR處理后，ERα核易位增加（圖5 C和D）。

同時，采用qPCR和WB技術(shù)評估ERα核易位對下游靶點Krt16水平的影響。有趣的是，結(jié)果顯示Krt16的表達顯著增加（圖5 E-G）。使用Kaplan-Meier繪圖儀在881例胃癌患者中鑒定了與總生存率相關(guān)的Krt16基因。如圖5 H所示，角蛋白16的高表達與胃癌總生存率較差相關(guān)。綜上所述，MC-LR通過降低Hsp90的磷酸化而過度激活雌激素信號通路，從而導(dǎo)致胃細胞中活化的ERα的核易位和Krt16的過表達（圖5 I）。

圖5 |?MC-LR通過損害Hsp90磷酸化介導(dǎo)的ERα核轉(zhuǎn)運來促進Krt16的表達

研究結(jié)論

飲用水中廣泛存在的藍藻毒素對公共健康構(gòu)成了威脅。MC-LR是MCs的一種主要毒性形式，已被發(fā)現(xiàn)在癌癥進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作者運用TMT標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了MC-LR可能有影響雌激素信號通路的潛能。它通過降低Hsp90的磷酸化，過度激活雌激素信號通路，從而導(dǎo)致胃細胞中激活的ERα的核易位和Krt16的過表達。這些結(jié)果可能為雌激素促進胃癌的發(fā)生發(fā)展提供了證據(jù)。

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本文通過TMT蛋白組學(xué)和磷酸化蛋白組學(xué)檢測了100 nM的MC-LR處理的和未受處理的SGC-7901細胞，確定了暴露于MC-LR的SGC-7901細胞的差異表達模式和異常通路。蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析表明，雌激素信號通路可能在MC-LR影響細胞中發(fā)揮重要作用。

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