目的蛋白不可溶，形成包涵體？
蛋白表達(dá)純化問題概述：
Q: 為什么目的蛋白總是以包涵體形式出現(xiàn)?
A: 在原核表達(dá)純化中目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯誤折疊，并聚集成為包涵體。經(jīng)過誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)通常可達(dá)細(xì)胞總蛋白的50%以上，雖然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多達(dá)95%的蛋白則存在于包涵體。如何獲得更多可溶蛋白。
原理解析：
優(yōu)化培養(yǎng)條件當(dāng)重組蛋白高效表達(dá)時，新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白的折疊速率，此時，蛋白就會以包涵體的形式在細(xì)胞內(nèi)形成。所以，降低蛋白的合成速率可一定程度上的改善重組蛋白的可溶性。
上清表達(dá)解決方案如下（按照可操作性的順序如下）：
1、誘導(dǎo)前，使用較低的細(xì)菌值，可以進(jìn)行測定，OD600（通常為0.6-0.8）；
2、改變誘導(dǎo)條件，低溫，可以測試不同的溫度梯度（如16°C，25°C，30°C，37°C等）、降低IPTG濃度（0.01-0.1mM）并延長誘導(dǎo)時間、長時間能夠保證細(xì)菌有足夠的時間進(jìn)行折疊。或者向培養(yǎng)基中加入0.4mol/L蔗糖，高滲引起了滲透性休克反應(yīng)，該反應(yīng)增加了細(xì)胞內(nèi)谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平，為蛋白的正確折疊提供了環(huán)境；?自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，適合于T7啟動子系列的誘導(dǎo)表達(dá)，當(dāng)工程菌增長到一定密度后，自己緩慢開啟誘導(dǎo)開關(guān)，緩慢誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利于蛋白正確折疊，便于可溶性表達(dá)。
3、更換載體；啟動子選擇?載體的啟動子對于可溶性表達(dá)影響至關(guān)重要，pET系列的?T7/T7 lac為強(qiáng)啟動子，強(qiáng)啟動子在提高蛋白產(chǎn)量的同時也增強(qiáng)了包涵體的形成，如果遇到此種情況可以考慮換用弱啟動子的載體，如pGEX系列，還可選擇含cspA啟動子的pCold系列載體。
4、使用促溶標(biāo)簽
采用融合標(biāo)簽表達(dá)融合標(biāo)簽用于檢測和純化目的蛋白，有時也通過增加目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的可溶性或幫助將目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表達(dá)載體或蛋白序列中常添加一些可溶性標(biāo)簽，如GST，NusA，MBP，Sumo等，這些標(biāo)簽在宿主中表達(dá)的蛋白質(zhì)會有高度的可溶性，在與外源蛋白質(zhì)融合后，從而促進(jìn)外源蛋白的可溶性表達(dá)。
這個需要解決的問題在于后續(xù)需要用蛋白工具酶切割融合蛋白，再純化除去工具酶和促溶蛋白，最終回收目的蛋白，純化操作可能會比較繁瑣。
如果有興趣，可以往下看，有更加詳細(xì)的描述。
目的蛋白不可溶，形成包涵體？
首先確認(rèn)目的蛋白是否有表達(dá)。裂解菌體并離心后，通過對全菌、上清、沉淀的檢測，確認(rèn)目的蛋白是否表達(dá)，是否形成了包涵體。包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達(dá)系統(tǒng)、誘導(dǎo)表達(dá)條件等因素有著密切關(guān)系。在無法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下，可以嘗試不同的表達(dá)載體與菌株，增強(qiáng)其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。目前認(rèn)為包涵體的形成是由于蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累速度過快，沒有正確折疊而聚集沉淀。可以通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如降低誘導(dǎo)時菌液的OD值等，以減緩蛋白的積累。
采用融合標(biāo)簽表達(dá)融合標(biāo)簽用于檢測和純化目的蛋白，有時也通過增加目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的可溶性或幫助將目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表達(dá)載體或蛋白序列中常添加一些可溶性標(biāo)簽，如GST，NusA，MBP，Sumo等，這些標(biāo)簽在宿主中表達(dá)的蛋白質(zhì)會有高度的可溶性，在與外源蛋白質(zhì)融合后，從而促進(jìn)外源蛋白的可溶性表達(dá)。
選擇合適的質(zhì)粒載體降低蛋白的合成速率除了改變誘導(dǎo)條件，還可以通過更換弱啟動子來調(diào)節(jié)。pET系列載體有T7/T7lac強(qiáng)啟動子，提高了重組蛋白的表達(dá)量，但是也增加了形成包涵體的概率。為了提高蛋白的可溶性表達(dá)，我們可以選擇讓弱啟動子或帶有融合標(biāo)簽的載體，如pCold、pBAD、pGEX等，這些載體在重組蛋白表達(dá)上可一定比例的提高蛋白的可溶性。
優(yōu)化培養(yǎng)條件當(dāng)重組蛋白高效表達(dá)時，新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白的折疊速率，此時，蛋白就會以包涵體的形式在細(xì)胞內(nèi)形成。所以，降低蛋白的合成速率可一定程度上的改善重組蛋白的可溶性；降低蛋白的合成速率有很多途徑，對于固有的質(zhì)粒載體來說，通常采用降低誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度的方法。為了提高蛋白可溶性的同時保證蛋白的表達(dá)量，我們可以對不同溫度梯度和誘導(dǎo)劑不同濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計，從而得到最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。
Q: 為什么目的蛋白總是以包涵體形式出現(xiàn)?
A: 在原核表達(dá)純化中目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯誤折疊，并聚集成為包涵體。經(jīng)過誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)通?？蛇_(dá)細(xì)胞總蛋白的50%以上，雖然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多達(dá)95%的蛋白則存在于包涵體。為了獲得更多可溶蛋白，在實(shí)驗(yàn)過程中，可以降低誘導(dǎo)溫度，例如16-30℃，或降低IPTG濃度（0.01-0.1mM）并延長誘導(dǎo)時間，還可以采用特別的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌。
表達(dá)為包涵體蛋白可能原因一是目的蛋白含有二硫鍵，二硫鍵形成困難，可以利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽，建議表達(dá)菌株是Origami 2，?Rosetta-gami 2，?Rosetta-gami B；二是表達(dá)過快，表達(dá)量過高，可以降低誘導(dǎo)溫度，IPTG濃度優(yōu)化，建議表達(dá)菌株是Tuner, Rosetta-gami B。
Q: 能不能說一下原核蛋白純化方式及選擇方法
A: 蛋白純化方法常用的有親和純化、離子交換、切膠回收。
1.?一般帶有HIS，GST，SUMO，F(xiàn)c等融合標(biāo)簽的蛋白，我們可以通過Ni柱、GST柱、protein A等進(jìn)行親和純化，用親和純化方法一般可以獲得85%以上純度的蛋白，方便快捷。
2.?如果不想讓重組蛋白帶有標(biāo)簽，可以先表達(dá)帶標(biāo)簽重組蛋白，親和純化后用蛋白工具酶切割融合蛋白，再純化除去工具酶。或者直接表達(dá)無標(biāo)簽重組蛋白，進(jìn)行離子、分子篩、疏水等純化。
3.如果需要表達(dá)的蛋白作為抗原，可以直接通過切膠回收的方式，此方法獲得蛋白純度較高，進(jìn)行免疫后獲得的抗體進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，靈敏度較高。
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Q: 獲得的蛋白是有活性的嗎？
A: 要讓原核表達(dá)重組蛋白有活性，條件很復(fù)雜，合適的緩沖液體系、鹽濃度、蛋白折疊狀態(tài)甚至檢測活性的方法的差別都可能導(dǎo)致蛋白活性差異。一般情況下，上清表達(dá)的蛋白要比包涵體經(jīng)過變復(fù)性純化得到的蛋白活性要好，所以我們盡量從上清中獲得蛋白，期許蛋白折疊達(dá)到最接近活性狀態(tài)。
載體上表達(dá)的蛋白“有問題”有時候，當(dāng)表達(dá)的蛋白是非溶性的，或折疊錯誤，不當(dāng)切割或?qū)?xì)菌宿主有毒性時，目的蛋白往往不能正常誘導(dǎo)表達(dá)。在這種情況下，您需要優(yōu)化誘導(dǎo)條件（詳見下文），或者替換成更耐受的宿主菌株或更換表達(dá)載體類型。誘導(dǎo)條件有待優(yōu)化根據(jù)待表達(dá)基因，表達(dá)載體和宿主菌株等因素，您可能需要考慮優(yōu)化以下誘導(dǎo)條件：OD600（通常為0.6-0.8）；誘導(dǎo)劑（如IPTG或L-阿拉伯糖）的濃度不能太低或太高；誘導(dǎo)持續(xù)時間不能太短或太長；誘導(dǎo)溫度，特別是在處理“有問題”蛋白時（見上文），可以測試不同的溫度梯度（如16°C，25°C，30°C，37°C等）。在極少數(shù)情況下，由于原因不明，相同表達(dá)載體的不同克隆可能會表現(xiàn)出不同的表達(dá)能力，因此您可能需要挑選多個單菌落進(jìn)行單獨(dú)測試，以篩選出具有最佳誘導(dǎo)效果的克隆。
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