胃癌（gastric cancer，GC）是嚴(yán)重影響人類健康的惡性腫瘤之一。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年新增GC患者超過100萬(wàn)人，GC的全球死亡率為7.7%。雖然近年來胃癌的診治策略不斷優(yōu)化，但整體預(yù)后仍不盡理想。因此，迫切需要進(jìn)一步探索GC的發(fā)病機(jī)制，以尋找有效的診斷和治療靶點(diǎn)。

胰島素樣生長(zhǎng)因子II mRNA結(jié)合蛋白3（Insulin like growth factor II mRNA binding protein 3，IGF2BP3）是RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）中的一種，在包括GC在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)升高，且促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。機(jī)制上，IGF2BP3在腫瘤中通常與mRNA結(jié)合，進(jìn)而影響mRNA的成熟、翻譯和穩(wěn)定性等發(fā)揮生物學(xué)功能。目前，IGF2BP3蛋白也逐漸被證實(shí)可以與非編碼RNA相互作用影響腫瘤的進(jìn)展。

環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）是非編碼RNA重要的新成員，在真核生物中大量表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，一些circRNAs已被證實(shí)在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。在GC中，有研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可以與IGF2BP3蛋白結(jié)合而參與GC的進(jìn)展[1,2]。然而，circRNAs是否直接調(diào)控GC中IGF2BP3的表達(dá)尚不清楚。因此，探索更多circRNA-IGF2BP3的作用方式，發(fā)現(xiàn)更多有功能的circRNA，對(duì)胃癌防治以及提高患者的生活質(zhì)量具有重要的意義。

2023年6月20日，重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院肖斌教授團(tuán)隊(duì)在《Journal of Translational Medicine》發(fā)表了題為“CircNFATC3 promotes the proliferation of gastric cancer through binding to IGF2BP3 and restricting its ubiquitination to enhance CCND1 mRNA stability”的研究論文。該研究揭示了一個(gè)新的circNFATC3-IGF2BP3-CCND1作用軸，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖；也揭示了環(huán)狀RNA與IGF2BP3互作的新模式，有可能成為新的GC治療靶點(diǎn)。

一、胃癌細(xì)胞中與IGF2BP3蛋白結(jié)合的circRNA篩選及circNFATC3的鑒定和表達(dá)分析

1.1 目的circRNA的確定

通過RIP-seq，作者發(fā)現(xiàn)SGC7901細(xì)胞中根據(jù)與IGF2BP3蛋白結(jié)合的circRNAs的評(píng)分（Read number）排名前四的分別是circELK4、circARID1A、circFNDC3B和circNFATC3；其中，circELK4在16對(duì)胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)無(wú)差異，而circARID1A、circFNDC3B和circNFATC3在胃癌組織中高表達(dá)；此外，circARID1A和circFNDC3B在GC中與IGF2BP3的相互作用已經(jīng)有報(bào)道。因此，作者研究了GC中未報(bào)道的circNFATC3，并進(jìn)一步評(píng)估其與IGF2BP3蛋白的相互作用。

1.2 CircNFATC3在GC細(xì)胞中的成環(huán)特性鑒定與定位檢測(cè)

作者通過Sanger測(cè)序、gDNA和cDNA為模板的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)、Oligo dT 實(shí)驗(yàn)、RNase R實(shí)驗(yàn)和放線菌素D實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了circNFATC3是一個(gè)由親本基因NFATC3的第2和3號(hào)外顯子組成、沒有5端帽結(jié)構(gòu)和3端polyA尾、高穩(wěn)定性的circRNA。核-質(zhì)分離及RNA-FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circNFATC3主要定位在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

1.3 CircNFATC3在胃癌組織中的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步檢測(cè)circNFATC3在胃癌中的表達(dá)，作者利用胃癌組織芯片檢測(cè)circNFATC3表達(dá)，結(jié)果表明CircNFATC3在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤體積成正相關(guān)。

1.4 CircNFATC3與IGF2BP3蛋白的結(jié)合驗(yàn)證

作者通過RIP、RNA pull-down和RNA-FISH/IF實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的結(jié)合關(guān)系。

二、CircNFATC3在GC增殖中的功能探索

作者通過CCK8、平板克隆形成和EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾circNFATC3后SGC7901和BGC823細(xì)胞的增殖能力顯著降低；并且，用膽固醇修飾的circNFATC3的siRNA瘤內(nèi)注射基于HGC27細(xì)胞構(gòu)建的裸鼠皮下移植瘤后，腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢；且腫瘤組織中circNFATC3和Ki-67表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果表明，干擾circNFATC3后可以抑制胃癌細(xì)胞的的體內(nèi)外增殖能力。

三、CircNFATC3促進(jìn)胃癌增殖的機(jī)制研究

3.1 探索circNFATC3與IGF2BP3間的相互調(diào)控關(guān)系

作者已經(jīng)證明了circNFATC3與IGF2BP3結(jié)合，但并不明確兩者是否存在相互調(diào)控關(guān)系。因此，作者通過調(diào)控實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步去檢測(cè)兩者間的調(diào)控關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3不影響circNFATC3的表達(dá)；但干擾circNFATC3后，IGF2BP3蛋白表達(dá)而非mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，circNFATC3可能在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)IGF2BP3的表達(dá)。

3.2 探索circNFATC3調(diào)控IGF2BP3蛋白表達(dá)的分子機(jī)制

作者用CHX聯(lián)合si-circNFATC3處理SGC7901和BGC823細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在兩種細(xì)胞系敲低circNFATC3后，IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定性明顯降低。這些結(jié)果表明，circNFATC3在GC中參與調(diào)控IGF2BP3蛋白降解。

自噬-溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解的兩種主要機(jī)制。因此，作者評(píng)估了circNFATC3敲低是否會(huì)誘導(dǎo)GC細(xì)胞自噬。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自噬標(biāo)記LC3A/B在circNFATC3敲低后沒有顯著改變；相比之下，蛋白酶體抑制劑MG132可以部分逆轉(zhuǎn)SGC7901和BGC823細(xì)胞中circNFATC3敲低所致的IGF2BP3蛋白的下降。且在si-circNFATC3處理的細(xì)胞中，泛素修飾的IGF2BP3蛋白顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，干擾circNFATC3可以通過泛素-蛋白酶體途徑來降解IGF2BP3蛋白。

TRIM25是IGF2BP3的E3泛素連接酶[3]，作者評(píng)估了TRIM25是否調(diào)節(jié)IGF2BP3在GC細(xì)胞中的表達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TRIM25的反向調(diào)控IGF2BP3蛋白的表達(dá)。此外，通過IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了IGF2BP3蛋白和TRIM25蛋白的相互結(jié)合關(guān)系，且IGF2BP3蛋白截短突變體N端和C端都能直接與TRIM25蛋白相互作用。并且，作者發(fā)現(xiàn)敲低TRIM25可以挽救circNFATC3敲低導(dǎo)致的IGF2BP3下調(diào)。這些結(jié)果表明，TRIM25可能參與circNFATC3干擾引起的IGF2BP3蛋白降解。

3.3 探索circNFATC3-IGF2BP3軸對(duì)GC細(xì)胞增殖的影響

作者通過體外回復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IGF2BP3能夠減弱si-circNFATC3對(duì)SGC7901和BGC823細(xì)胞增殖的抑制作用。

3.4 CircNFATC3與IGF2BP3下游靶基因的篩選及驗(yàn)證

為了更全面地研究IGF2BP3和circNFATC3的功能，作者進(jìn)一步探索了兩者共同調(diào)控的下游靶基因。首先，作者通過分析以下三個(gè)數(shù)據(jù)集：SGC7901細(xì)胞干擾IGF2BP3后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序下調(diào)的mRNA、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌組織顯著上調(diào)的mRNA（Log2（Fold Change）＞2），以及RIP-seq技術(shù)篩選與IGF2BP3蛋白結(jié)合的mRNA。三者求取交集，作者發(fā)現(xiàn)RCC2、ARL6IP1、CCND1、KRT7和MUC13是circNFATC3和IGF2BP3的潛在靶基因。通過調(diào)控實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCND1是IGF2BP3和circNFATC3共同調(diào)控的靶基因。

IGF2BP3是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，機(jī)制上通常與mRNA結(jié)合后促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性而發(fā)揮功能[4-6]。為了驗(yàn)證IGF2BP3是否影響CCND1的mRNA穩(wěn)定性，作者首先通過RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IGF2BP3蛋白與CCND1的mRNA結(jié)合關(guān)系。其次，作者通過放線菌素D實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circNFATC3與IGF2BP3蛋白能促進(jìn)CCND1 mRNA穩(wěn)定性。

3.5 CircNFATC3通過CCND1促進(jìn)GC增殖的功能研究

通過實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)干擾CCND1能抑制GC細(xì)胞的增殖。并且，體內(nèi)外回復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)CCND1可以部分回復(fù)si-circNFATC3引起的增殖抑制。這些結(jié)果表明，circNFATC3通過調(diào)節(jié)CCND1途徑促進(jìn)GC的增殖。

綜上所述，circNFATC3是一個(gè)與IGF2BP3蛋白結(jié)合的circRNA，其在GC組織中的表達(dá)水平顯著升高，且與腫瘤體積呈正相關(guān)。功能上，干擾circNFATC3表達(dá)會(huì)抑制GC細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖。機(jī)制上，circNFATC3可能通過抑制TRIM25介導(dǎo)的IGF2BP3蛋白泛素化，增強(qiáng)了IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)CCND1 mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)了GC增殖。近年來，肖斌教授團(tuán)隊(duì)在環(huán)狀RNA與IGF2BPs蛋白家族互作方面取得了一系列成果，證實(shí)環(huán)狀RNA-IGF2BPs的作用方式復(fù)雜多樣，可以通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、協(xié)同促進(jìn)、協(xié)同抑制等機(jī)制，影響下游基因的mRNA穩(wěn)定性，調(diào)控腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移（J Exp Clin Cancer Res.2022 Aug 19;41(1):251；Clin Transl Med.2022 Jul;12(7):e994；Mol Ther Nucleic Acids.2021.26:649-664）。本研究是對(duì)環(huán)狀RNA-IGF2BPs互作方式的有力補(bǔ)充，證明環(huán)狀RNA還能通過穩(wěn)定IGF2BPs蛋白發(fā)揮促癌功能?？傊?，環(huán)狀RNA-IGF2BPs的互作為腫瘤的治療提供了新靶點(diǎn)。

原文鏈接：

https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12967-023-04235-y

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