上期為大家介紹了自噬干貨分享系列之經(jīng)典自噬研究，那么本期將繼續(xù)進(jìn)行“自噬干貨分享”，小編將帶大家一起來了解下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中的一種多功能細(xì)胞器，在蛋白質(zhì)折疊、修飾、脂質(zhì)和激素合成、離子儲(chǔ)存、代謝調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外因素刺激時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量積累，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)就會(huì)受到破壞。此時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自我保護(hù)程序，即未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），增強(qiáng)蛋白折疊活性，降低蛋白翻譯水平，加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（ER-associated protein degradation，ERAD）。持續(xù)地內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬（ER-phagy），以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)平衡。

Bernales等人在2007年首次提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的概念。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可分為（圖1）：大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬（是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留受體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)受體介導(dǎo)，這些受體招募自噬機(jī)制，然后將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向到自噬體中，包裹內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片的自噬體與溶酶體融合以降解其內(nèi)容物）；微內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬（不需要受體或形成自噬體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片直接被溶酶體吞噬）；此外，溶酶體也可直接與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的囊泡融合并進(jìn)行降解（需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體介導(dǎo)，但不涉及自噬體的形成），這一過程也稱作ERLAD（ER-to-lysosome-associated degradation）。

圖1. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬

本期內(nèi)容小編將主要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬過程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬監(jiān)測方法及應(yīng)用案例來進(jìn)行介紹。

01內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬過程

大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是一個(gè)多步驟的過程：在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)下（如未折疊蛋白反應(yīng)、蛋白質(zhì)聚集、營養(yǎng)缺乏和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞等），需要降解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分可以被特定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體識(shí)別和標(biāo)記。同時(shí)，細(xì)胞通過抑制mTOR或AMPK直接磷酸化Atg1/ULK1（哺乳動(dòng)物中Atg1的同源物）來激活自噬體起始復(fù)合物，從而啟動(dòng)隔離膜的組裝。類泛素蛋白Atg8/LC3/GABARAP將被招募到形成中的隔離膜上來幫助膜擴(kuò)張，并識(shí)別和結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體。之后，隨著隔離膜逐漸擴(kuò)張和閉合，與待降解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)子域以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體形成自噬體，最終自噬體與溶酶體融合并降解底物（圖2）。

圖2. 大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬

微內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬：在酵母中，當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度擴(kuò)張時(shí)，一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以形成輪狀結(jié)構(gòu)，然后被內(nèi)陷的液泡膜吸收到液泡中進(jìn)行降解。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，突變的I型前膠原蛋白可以被募集到 ERES（ER exit sites，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口位點(diǎn)），COPII 外殼蛋白和自噬相關(guān)蛋白（SQSTM1、LC3 等）也可以被募集到這一位點(diǎn)，然后包含這些蛋白的ERES通過泛素化修飾并在微自噬等過程中被溶酶體吞沒。

ERLAD：當(dāng)α1-抗胰蛋白酶Z（ATZ）聚合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚時(shí)，分子伴侶蛋白如CALNEXIN可以將聚集體所在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞區(qū)分離。然后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體FAM134B的協(xié)助下，在該區(qū)域形成來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的、單層膜囊泡。此外，F(xiàn)AM134B與LC3的結(jié)合可以促進(jìn)囊泡對(duì)RAB7/LAMP1陽性的內(nèi)吞溶酶體膜的對(duì)接。最終，包含聚集體的囊泡與內(nèi)吞溶酶體融合而被降解。

02內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體

2015年Nakatogawa和Dikic團(tuán)隊(duì)分別在nature雜志報(bào)道了酵母和哺乳動(dòng)物中第一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體Atg40和FAM134B。到目前為止，哺乳動(dòng)物中已經(jīng)有11個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體被報(bào)道，F(xiàn)AM134B、FAM134A、FAM134C、RTN3L、CCPG1、SEC62、TEX264、ATL3、CALCOCO1、p62和CDK5RAP3（圖3）。

圖3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體

在酵母中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體通過Atg8互作基序（Atg8-interacting moti，AIM）與自噬體上的Atg8結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被自噬體包裹。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)Atg8同源物，包括LC3 的3種亞型（LC3A, LC3B和LC3C）和γ-氨基丁酸（GABA）-A型受體相關(guān)蛋白的3種亞型（GABARAP，GABARAPL1和GABARAPL2）。與酵母中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體和Atg8之間的相互作用一樣，哺乳動(dòng)物中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體也通過LC3互作區(qū)（LC3-interacting

Region，LIR）與LC3和GABARAP家族蛋白結(jié)合，從而促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段被自噬體包裹。

03內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬監(jiān)測方法

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬活性監(jiān)測對(duì)于闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的分子機(jī)制、生理和病理作用以及尋找調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的藥物具有重要意義。

透射電子顯微鏡可以觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬（圖4），但無法衡量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬活性。一些內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（如RTN1、RTN3、RTN4、REEP5、CLIMP63和Trap-α）在自噬中表達(dá)水平下降，但變化通常很小。相比之下，饑餓誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體蛋白（如CCPG1和TEX264）的降解更明顯，但它們是選擇性降解的，并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬過程中也可能被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，不太能真實(shí)反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平。但熒光標(biāo)記的報(bào)告載體是自噬研究最常用的手段，如漢恒生物自噬研究的 “王牌工具” mcherry-EGFP-LC3自噬雙標(biāo)病毒等，可以靈敏地衡量自噬水平。

圖4. 小鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬透射電鏡圖（紅色箭頭表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，黑色箭頭表示自噬體膜）

基于此，漢恒生物最新推出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬監(jiān)測工具。通過將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列與RFP-GFP熒光串聯(lián)序列融合表達(dá)來構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬報(bào)告載體ssmRFP1-EGFP-KDEL（ss：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽序列，ER signal sequence；KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列）（圖5A）和mCherry-EGFP-RAMP4（RAMP4：即SERP1基因，Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1，可以特異性定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上）（圖5B）。在細(xì)胞質(zhì)中，紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白同時(shí)表達(dá)，表現(xiàn)為黃色；若發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，由于溶酶體偏酸性的環(huán)境，綠色熒光蛋白淬滅，只剩下紅色熒光信號(hào)。此外，在溶酶體中，報(bào)告載體ssmRFP1-EGFP-KDEL中的mRFP1與EGFP間的linker會(huì)被剪切，因此也可通過Western Blot結(jié)果統(tǒng)計(jì)mRFP1/mRFP1-EGFP比值來指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。

圖5. 漢恒內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬監(jiān)測工具原理圖

04應(yīng)用案例

2019年東京大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)為了研究TEX264是否為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體，利用ssmRFP1-EGFP-KDEL工具對(duì)野生型WT、FIP200-KO（自噬功能缺陷）及TEX264-KO的HeLa細(xì)胞在營養(yǎng)和饑餓條件下進(jìn)行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬監(jiān)測，并通過在TEX264-KO的HeLa細(xì)胞中回補(bǔ)TEX264野生型及LIR突變型LIR4A，結(jié)合熒光成像（圖6A，圖6B)和Western Blot實(shí)驗(yàn)（圖6C，圖6D)，證明了TEX264是一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體。

圖6. ssmRFP1-EGFP-KDEL工具監(jiān)測HeLa細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬

威斯康星大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)2021年的文章中為了研究Atase1或Atase2的敲除是否會(huì)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，利用mCherry-EGFP-RAMP4工具在小鼠胚胎成纖維MEF細(xì)胞中監(jiān)測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。通過熒光成像（圖7），統(tǒng)計(jì)有紅色熒光斑點(diǎn)的細(xì)胞占比（指示自噬溶酶體），證明了Atase1敲除，而不是Atase2敲除，會(huì)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。

圖7. mCherry-EGFP-RAMP4工具監(jiān)測MEF細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬

本期“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬研究”的介紹就到此結(jié)束了，希望可以幫助大家了解到一定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬基礎(chǔ)知識(shí)，并對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬監(jiān)測報(bào)告載體有一定的認(rèn)識(shí)。下期我們將繼續(xù)“自噬干貨分享之線粒體自噬研究”，我們下期見哦。

參考文獻(xiàn)

1. He L, Qian X, Cui Y. Advances in ER-Phagy and Its Diseases Relevance. Cells. 2021;10(9):2328. Published 2021 Sep 6. doi:10.3390/cells10092328

2. Bernales S, Schuck S, Walter P. ER-phagy: selective autophagy of the endoplasmic reticulum. Autophagy. 2007;3(3):285-287. doi:10.4161/auto.3930

3. Reggiori F, Molinari M. ER-phagy: mechanisms, regulation, and diseases connected to the lysosomal clearance of the endoplasmic reticulum. Physiol Rev. 2022;102(3):1393-1448. doi:10.1152/physrev.00038.2021

4. Chino H, Mizushima N. ER-Phagy: Quality Control and Turnover of Endoplasmic Reticulum. Trends Cell Biol. 2020;30(5):384-398. doi:10.1016/j.tcb.2020.02.001

5. Mochida, K., Oikawa, Y., Kimura, Y., Kirisako, H., Hirano, H., Ohsumi, Y., et al. (2015). Receptor-mediated Selective Autophagy Degrades the Endoplasmic Reticulum and the Nucleus. Nature 522, 359–362. doi:10.1038/nature14506

6. Khaminets, A., Heinrich, T., Mari, M., Grumati, P., Huebner, A. K., Akutsu, M., et al. (2015). Regulation of Endoplasmic Reticulum Turnover by Selective Autophagy. Nature 522, 354–358. doi:10.1038/nature14498

7. Mochida K, Nakatogawa H. ER-phagy: selective autophagy of the endoplasmic reticulum. EMBO Rep.? ? ?2022;23(8):e55192. doi:10.15252/embr.202255192

8. Li J, Gao E, Xu C, Wang H, Wei Y. ER-Phagy and Microbial Infection. Front Cell Dev Biol. 2021;9:771353. Published 2021 Nov 29. doi:10.3389/fcell.2021.771353

9. Chino H, Hatta T, Natsume T, Mizushima N. Intrinsically Disordered Protein TEX264 Mediates ER-phagy. Mol Cell. 2019;74(5):909-921.e6. doi:10.1016/j.molcel.2019.03.033

10. Liang JR, Lingeman E, Ahmed S, Corn JE. Atlastins remodel the endoplasmic reticulum for selective autophagy. J Cell Biol. 2018;217(10):3354-3367. doi:10.1083/jcb.201804185

11. Rigby MJ, Lawton AJ, Kaur G, et al. Endoplasmic reticulum acetyltransferases Atase1 and Atase2 differentially regulate reticulophagy, macroautophagy and cellular acetyl-CoA metabolism. Commun Biol. 2021;4(1):454. Published 2021 Apr 12. doi:10.1038/s42003-021-01992-8