來源??TMR Publishing Group

作者??Traditional Medicine Research 編輯部??

鉤藤被廣泛用于治療肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，驚癇抽搐，高熱驚厥。

鉤藤的主要化學(xué)成分有生物堿、三萜酸類、黃酮類、酚類和香豆素，其中生物堿是其重要的活性成分，且豐度較高，具有顯著的抗炎、降壓和抗神經(jīng)退行性作用。

中國科學(xué)院上海藥物研究所果德安教授團(tuán)隊(duì)最新研究?Pseudotargeted metabolomics for exploring the changes of neurotransmitters profile in aging rat brain and the potential neuroprotective effect of alkaloids from Uncaria rhynchophylla.?Tradit Med Res. 2022;7(5):41. doi:10.53388/TMR20220303002?通過傳統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)合擬靶向代謝組學(xué)手段對(duì)鉤藤生物堿的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了研究。

研究方法

使用20種不同的提取溶劑，采用液-液萃?。↙LE）、蛋白沉淀（PPT）和固相萃?。⊿PE）等方法對(duì)大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。利用UHPLC-MS/MS技術(shù)建立一種檢測(cè)腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的擬靶向代謝組學(xué)方法，結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估鉤藤生物堿的神經(jīng)保護(hù)作用。

研究結(jié)果

提取方法的優(yōu)化

對(duì)比了LLE、PPT和SPE三種提取方法發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)可在SPE的清洗步驟中檢測(cè)到，因此SPE不適用于神經(jīng)遞質(zhì)的提取。在LLE方法中，非極性萃取劑提取出的神經(jīng)遞質(zhì)成分較少，而極性萃取劑(正丁醇和異丙醇)可以提取大部分神經(jīng)遞質(zhì)成分。甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-乙腈混合溶劑作為蛋白質(zhì)沉淀劑提取神經(jīng)遞質(zhì)的能力很強(qiáng)，如圖1所示。通過比較各種神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)應(yīng)的相對(duì)峰面積發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈(4:1,v/v)的PPT法表現(xiàn)出優(yōu)越的提取能力。

方法驗(yàn)證

方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示線性、精密度和穩(wěn)定性均滿足擬靶向代謝組學(xué)的要求(表1)。在腦組織勻漿液中每種分析物均具有較好的線性(圖2)，且所有分析物的r2值均大于0.8,其中有71%的待測(cè)物超過0.95。此外，日內(nèi)精度RSD為2.55% ~ 9.03%，日間精度RSD為2.02% ~ 12.55%，因此可認(rèn)為日內(nèi)和日間精確度符合實(shí)驗(yàn)要求。穩(wěn)定性RSD為3.68%~9.24%，表明神經(jīng)遞質(zhì)在24h內(nèi)無明顯變化，待測(cè)物穩(wěn)定性符合實(shí)驗(yàn)要求。

生物樣本分析

該研究測(cè)定了1月和8月鼠齡的大鼠腦組織樣本中神經(jīng)遞質(zhì)的代謝譜。采用無監(jiān)督模式識(shí)別和有監(jiān)督模式識(shí)別(OPLS-DA)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定了7種差異性成分，即γ-氨基丁酸、亮氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸和色氨酸，這些差異性成分隨著大鼠年齡增長而增加。大鼠大腦中神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化情況如圖3所示。

腦組織中鉤藤生物堿分析

生物堿是鉤藤的主要活性成分，大鼠灌胃鉤藤水煎劑后，利用鉤藤生物堿對(duì)照品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在腦組織中鑒定出了7種生物堿，分別為鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚。因此，可認(rèn)為鉤藤生物堿可以穿過大鼠的血腦屏障。

?

生物堿對(duì)谷氨酸（Glu）誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響

通過細(xì)胞活力測(cè)定法評(píng)價(jià)生物堿對(duì)Glu誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，如圖4所示，與對(duì)照組（相對(duì)細(xì)胞活性為100%）相比，Glu處理組的細(xì)胞活性顯著降低（42.37%±1.48%），而去氫毛鉤藤堿（84.63%±2.25%）、毛鉤藤堿（83.16%±3.26%）和縫籽嗪甲醚（92.06%±3.60%）則顯著提高了Glu誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的活性。

?

生物堿對(duì)Glu誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中ROS、SOD、MDA和GSH水平的影響

如圖5A所示，Glu導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中ROS水平升高，而去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚降低了Glu誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中ROS水平。MDA、GSH和SOD的水平測(cè)定結(jié)果如圖5B-D所示，與陰性對(duì)照相比，Glu誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD水平顯著降低、MDA含量顯著升高，而去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚干預(yù)Glu誘導(dǎo)的細(xì)胞后，細(xì)胞的MDA水平顯著降低、GSH和SOD的水平顯著升高，說明去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

?

生物堿對(duì)Glu誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與陰性對(duì)照相比，Glu顯著提高了cleaved-caspase-3的表達(dá)水平，而去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚降低了Glu誘導(dǎo)的SH-SY5細(xì)胞中cleaved-caspase-3的表達(dá)，說明生物堿對(duì)Glu誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用。此外，這些生物堿還降低了Glu處理的SH-SY5細(xì)胞中p-ERK和p-p38的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿和縫籽嗪甲醚可通過ROS-MAPK/ERK信號(hào)通路有效地降低Glu誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和氧化損傷，可作為治療神經(jīng)性疾病的候選藥物。

?

結(jié)論

本研究對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的提取方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，認(rèn)為甲醇-乙腈(4:1,v/v) PPT法對(duì)腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)具有較好的提取能力。建立了同時(shí)檢測(cè)26種神經(jīng)遞質(zhì)的分析方法，在大鼠腦組織中共檢測(cè)到21種神經(jīng)遞質(zhì)，其中7種氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)(天冬氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、纈氨酸和γ-氨基丁酸)在1至8個(gè)月大鼠之間發(fā)生了顯著變化。對(duì)灌胃鉤藤水煎液后的大鼠腦組織進(jìn)行分析，共檢測(cè)出了7種生物堿，確定了鉤藤中的生物堿能穿過血腦屏障。通過檢測(cè)Glu誘導(dǎo)的SH-SY5細(xì)胞中與氧化應(yīng)激相關(guān)的因子的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)鉤藤生物堿可通過抑制氧化應(yīng)激和凋亡途徑降低Glu誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的興奮性神經(jīng)毒性，為鉤藤用于治療衰老相關(guān)疾病提供可靠依據(jù)。

?掃描二維碼獲取全文

引用格式
Li SW, Wu YS, Wu SF, et al. Pseudotargeted metabolomics for exploring the changes of neurotransmitters profile in aging rat brain and the potential neuroprotective effect of alkaloids from Uncaria rhynchophylla. Tradit Med Res. 2022;7(5):41. doi:10.53388/TMR20220303002

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究 Traditional Medicine Research（ISSN 2413-3973）創(chuàng)刊于2016年，專注于發(fā)表具有明確歷史記載、民族特色和地域特色的傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)研究和相關(guān)社會(huì)科學(xué)研究。目前已被Emerging Sources Citation Index (ESCI), 中科院期刊分區(qū), Embase, ProQuest 等數(shù)據(jù)庫收錄。

2022年期刊免除版面費(fèi)
官網(wǎng)：https://www.tmrjournals.com/tmr
郵箱：tmr@tmrjournals.com