歐易單細(xì)胞測(cè)序繼續(xù)發(fā)力！近日，歐易生物合作客戶復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院王群教授團(tuán)隊(duì)在Oncogenesis (IF 7.480) 發(fā)表食管鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)前使用新輔助化療手段——紫杉醇加順鉑化療的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)研究論文，歐易生物提供了該項(xiàng)目單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相關(guān)工作，下面我們一起學(xué)習(xí)這篇文章的具體內(nèi)容。

基本信息

材料：5例單純手術(shù)治療腫瘤組織、5例新輔助治療腫瘤組織

期刊：Oncogenesis

發(fā)表時(shí)間：2021年10月

方法：歐易生物?10× Genomics scRNA-seq

研究背景和研究目的

食管鱗狀細(xì)胞癌?(ESCC)?占全世界食管癌病例的90%。雖然新輔助化療?(NACT-ESCC)?提高了ESCC患者的生存率，但患者的5年生存率仍然較低，約13.9%的ESCC患者在接受NACT聯(lián)合手術(shù)方案后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移，表明ESCC復(fù)雜性。因此，這篇文章旨在利用單細(xì)胞測(cè)序深入探討腫瘤微環(huán)境?(TME) ，幫助我們?nèi)胬斫鈫渭兪中g(shù)治療?(SA-ESCC)?與NACT-ESCC之間的免疫微環(huán)境差異，為未來ESCC的治療提供參考。

內(nèi)容概述

作者從10個(gè)樣本中共獲得113581個(gè)細(xì)胞，構(gòu)建了一個(gè)基于SA-ESCC細(xì)胞和NACT-ESCC細(xì)胞的單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。作者首先對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)NACT-ESCC來源的惡性上皮處于“中間過渡狀態(tài)”。對(duì)免疫細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，NACT-ESCC組織中高表達(dá)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）marker ，同時(shí)抗炎marker APOE、APOC1和SPP1在TAM中高表達(dá)，表明抗炎型巨噬細(xì)胞增多。此外，研究發(fā)現(xiàn)ESCC術(shù)前是否化療，其CD8+?T細(xì)胞有顯著差異。

研究?jī)?nèi)容解析

1.?SA-ESCC和NACT-ESCC總單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

作者從來源于5例SA-ESCC和5例NACT-ESCC患者腫瘤組織中分離113581個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析 (Fig. 1A)?；谇捌谘芯?，借助SingleR數(shù)據(jù)集、Cellmarker數(shù)據(jù)庫(kù)等工具，降維聚類后的細(xì)胞被定義為上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞?(成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞) 和免疫細(xì)胞?(T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞和肥大細(xì)胞)?(Fig. 1B, C)。各樣本細(xì)胞分布比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與SA-ESCC患者相比，NACT-ESCC患者中免疫細(xì)胞?(特別是T細(xì)胞和B細(xì)胞) 的占比更高，而上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞占比明顯較低 (Fig. 1D)。這些結(jié)果提示NACT治療后患者抗腫瘤免疫反應(yīng)增強(qiáng)。

此外，作者探討了SA-ESCC和NACT-ESCC組以及各組細(xì)胞類群之間腫瘤發(fā)生中涉及的經(jīng)典細(xì)胞因子和信號(hào)通路的表達(dá)差異 (Fig. 1E)。細(xì)胞因子和NF-kB通路相關(guān)基因?(TNFSF13B, IL6和NKFB1) 在單核細(xì)胞中的基因表達(dá)升高，提示單核細(xì)胞在ESCC腫瘤發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。

Figure 1. SA-ESCC和NACT-ESCC單細(xì)胞圖譜

2.?NACT-ESCC上皮細(xì)胞單細(xì)胞圖譜特征

上皮細(xì)胞重降維聚類之后分為7個(gè)cluster (Fig. 2A)。通過腫瘤上皮細(xì)胞marker (EPCAM, MDK和SOX4)和非惡性上皮細(xì)胞marker (KRT5和KRT14)?定義各個(gè)亞群 (Fig. 2B)。InferCNVs分析顯示，與正常上皮細(xì)胞亞群相比，腫瘤上皮細(xì)胞亞群的惡性化評(píng)分顯著更高 (Fig. 2C)。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)非惡性上皮細(xì)胞中，SA-ESCC相比于NACT-ESCC非惡性上皮細(xì)胞占比更高 (Fig. 2D)。針對(duì)惡性與非惡性上皮細(xì)胞作差異基因分析，發(fā)現(xiàn)與預(yù)后差相關(guān)的基因?(例如：SOX4和MDK)?主要在SA-ESCC惡性上皮細(xì)胞中上調(diào)，免疫相關(guān)基因?(例如：IGLC2、FABP5和S100A2)?在非惡性上皮細(xì)胞中上調(diào) (Fig. 2E)。

此外，非惡性上皮細(xì)胞根據(jù)來源分為兩個(gè)亞群 (Fig. 2E)，這表明非惡性上皮細(xì)胞的異質(zhì)性。對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞的分化軌跡以SA-ESCC非惡性上皮細(xì)胞為起點(diǎn)，之后轉(zhuǎn)變?yōu)镹ACT-非惡性上皮細(xì)胞，NACT-惡性上皮細(xì)胞處于“中間過渡狀態(tài)”。隨后，上皮細(xì)胞的軌跡產(chǎn)生分支，一部分分化為SA-ESCC惡性上皮細(xì)胞，一部分分化為不同來源的正常上皮細(xì)胞。這些結(jié)果揭示了SA-ESCC和NACT-ESCC中上皮細(xì)胞復(fù)雜的重編程過程。

?Figure 2. 非惡性和惡性食管上皮細(xì)胞單細(xì)胞圖譜

3.?構(gòu)建SA-ESCC和NACT-ESCC單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)

作者通過細(xì)胞間相互作用構(gòu)建單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)來探究從SA-ESCC到NACT-ESCC的細(xì)胞和分子變化。SA-ESCC中的基質(zhì)細(xì)胞，特別是成纖維細(xì)胞，與其他細(xì)胞之間存在高度的細(xì)胞間通訊交流 (Fig. 3)。相反，NACT-ESCC中的免疫細(xì)胞，特別是T細(xì)胞和單核細(xì)胞在TME中起主要作用。作者還對(duì)NACT-ESCC和SA-ESCC中的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行代謝分析，發(fā)現(xiàn)SA-ESCC中惡性和非惡性上皮細(xì)胞中代謝通路富集均上調(diào)，例如：TCA循環(huán)通路 (Fig. 3)。而在NACT-ESCC組中，這些通路僅在非惡性上皮細(xì)胞中上調(diào)。這些結(jié)果表明，與SA-ESCC相比，NACT-ESCC具有獨(dú)特的TME，并且根據(jù)代謝分析結(jié)果，線粒體可能是SA-ESCC的潛在治療靶點(diǎn)。

Figure 3. SA-ESCC和NACT-ESCC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

4.?化療后肌成纖維細(xì)胞和腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞水平明顯下降

作者接下來對(duì)ESCC中的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分析。對(duì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞重降維聚類，內(nèi)皮細(xì)胞被定義為：免疫EDC、淋巴EDC、腫瘤ED和血管EDC (Fig. 4A)，成纖維細(xì)胞被定義為：COL14A1+基質(zhì)成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞?(Fig. 4B)。針對(duì)EDC，作者發(fā)現(xiàn)NACT-ESCC組的腫瘤EDC比例較低，而免疫EDC比例較高 (Fig. 4A)。接下來，作者對(duì)腫瘤EDC進(jìn)行GSVA分析，發(fā)現(xiàn)NACT-ESCC腫瘤EDC中的代謝途徑被激活 (Fig. 4C)。對(duì)免疫EDC進(jìn)行差異基因分析，發(fā)現(xiàn)促癌基因在SA-ESCC中高表達(dá) (Fig. 4D)，而在NACT-ESCC組中，HSP家族基因的表達(dá)顯著升高。據(jù)報(bào)道，HSP家族基因過表達(dá)促進(jìn)多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[1, 2]，這提示HSP家族基因可能是NACT-ESCC的潛在治療靶點(diǎn)。

對(duì)于成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。與SA-ESCC相比，COL14A1+基質(zhì)成纖維細(xì)胞主要富集于NACT-ESCC，而肌成纖維細(xì)胞主要富集于SA-ESCC (Fig. 4B)。α-SMA (ACTA2基因產(chǎn)物)?作為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，能夠反映其浸潤(rùn)程度 (Fig. 4E)。此外，與Wnt和Notch信號(hào)通路密切相關(guān)的POSTN和WNT5A在肌成纖維細(xì)胞中高表達(dá) (Fig. 4F)。GSVA分析顯示W(wǎng)nt和Notch信號(hào)通路在肌成纖維細(xì)胞中富集，而COL14A1?+?基質(zhì)成纖維細(xì)胞在抵抗基質(zhì)微環(huán)境中異常應(yīng)激水平方面發(fā)揮著重要作用?(Fig. 4G)。

Figure 4. SA-ESCC和NACT-ESCC中基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜

5.?巨噬細(xì)胞在SA-ESCC和NAT-ESCC中發(fā)揮不同的作用

根據(jù)CD68和LYZ的表達(dá)，共選擇16305個(gè)髓系細(xì)胞重降維聚類，聚類后細(xì)胞類型主要包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC和未定義髓系細(xì)胞。與SA-ESCC組相比，NACT-ESCC組巨噬細(xì)胞水平比例降低，單核細(xì)胞比例升高 (Fig. 5A)。SPP1是多種腫瘤的預(yù)后不良標(biāo)志物[3, 4]，在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)SPP1主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá) (Fig. 5B)。擬時(shí)序分析進(jìn)一步闡明了單核細(xì)胞到巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變 (Fig. 5C)。此外，巨噬細(xì)胞的GSVA分析顯示，與抗腫瘤相關(guān)的通路在NACT-ESCC中富集，與促腫瘤相關(guān)的通路在SA-ESCC的巨噬細(xì)胞中富集 (Fig. 5D)。對(duì)NACT-ESCC和SA-ESCC細(xì)胞進(jìn)行SCENIC分析 (Fig. 5E)，NACT-ESCC巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子SPI1和KLF4調(diào)節(jié)的基因表達(dá)水平顯著升高 (Fig. 5E)。

這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索SA-ESCC和NACT-ESCC中的髓系細(xì)胞多樣性提供了基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)的分布發(fā)現(xiàn)，與單核細(xì)胞相比，巨噬細(xì)胞中與抑制CD8+?T細(xì)胞活性相關(guān)的基因PDCD1LG2 (PD1-L2)、CD274 (PD-L1)、CD276 (B7-H3) 和LAG3的表達(dá)升高 (Fig. 5F)。與巨噬細(xì)胞相比，單核細(xì)胞中促炎相關(guān)免疫檢查點(diǎn)基因?(IL1A和IL6) 的表達(dá)顯著升高。這些marker是髓系細(xì)胞免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

Figure 5. SA-ESCC和NAT-ESCC中髓系細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜

6.?化療改變了漿細(xì)胞在TME中的作用

基于CD79A和IGKC的表達(dá)，共選擇2999個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行下游分析。B細(xì)胞重降維聚類后，分為3個(gè)cluster (Fig. 6A)。與SA-ESCC相比，NACT-ESCC漿細(xì)胞比例增加 (Fig. 6B)。GSVA分析顯示，干擾素反應(yīng)相關(guān)途徑在NACT-ESCC來源的漿細(xì)胞中富集 (Fig. 6C)。通過SCENIC分析漿細(xì)胞和濾泡B細(xì)胞中基因表達(dá)差異的潛在調(diào)控因子?(Fig. 6D)，STAT3調(diào)控的基因在濾泡B細(xì)胞中表達(dá)水平升高，而在漿細(xì)胞中，特別是NACT-ESCC患者漿細(xì)胞中，ATF3表達(dá)水平較高。這些發(fā)現(xiàn)表明B細(xì)胞在NACT-ESCC和SA-ESCC患者中具有復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

Figure 6. SA-ESCC和NAT-ESCC中B細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜

7.?SA-ESCC和NAT-ESCC患者中CD8+?T細(xì)胞的顯著差異變化

根據(jù)CD3D和CD3E的表達(dá)，共篩選出36706個(gè)T細(xì)胞重降維聚類，根據(jù)經(jīng)典marker的表達(dá)，共鑒定出六種細(xì)胞類型 (Fig. 7A)。與SA-ESCC中的T細(xì)胞亞型相比，NACT-ESCC患者的CD8+?T細(xì)胞水平顯著升高。此外，在NACT-ESCC中觀察到NKT、Th和CD4+?T占比明顯更低 (Fig. 7B)，且CD4+?T細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)較高的na?ve和co-stimulatory marker的表達(dá) (Fig. 7C)。作者接下來對(duì)NACT-ESCC和SA-ESCC之間T細(xì)胞亞型的相似性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NACT-ESCC和SA-ESCC中CD8+?T細(xì)胞中存在顯著差異?(Fig. 7D)。對(duì)CD8+?T重新降維聚類，定義聚類后細(xì)胞為cytotoxic CD8+?T細(xì)胞, exhausted CD8+?T細(xì)胞和na?ve CD8+?T細(xì)胞 (Fig. 7E)。NACT-ESCC中exhausted CD8+?T細(xì)胞和na?ve CD8+T細(xì)胞水平顯著升高，這意味著化療改變了ESCC的TME。以上結(jié)果表明，NACT-ESCC和SA-ESCC患者之間CD8+?T細(xì)胞的不同激活/衰竭狀態(tài)。

Figure 7. SA-ESCC和NAT-ESCC中T細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜

作者進(jìn)一步利用擬時(shí)序分析CD8+?T細(xì)胞群的過渡狀態(tài) (Fig. 8A，B)，整個(gè)擬時(shí)序軌跡上，呈現(xiàn)出由na?ve CD8+?T，cytotoxic CD8+?T到exhausted CD8+?T細(xì)胞的變化。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)，來自SA-ESCC患者的CD8+?T細(xì)胞主要為na?ve CD8+?T和cytotoxic CD8+?T，而隨著擬時(shí)序時(shí)間的發(fā)展，?NACT-ESCC患者的exhausted CD8+?T細(xì)胞逐漸增加(Fig. 8C，D)。盡管在NACT-ESCC和SA-ESCC樣本的CD8+?T細(xì)胞中觀察到相似的變化軌跡，但其具有不同的免疫和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這表明SA-ESCC和NACT-ESCC患者的治療應(yīng)考慮不同的免疫治療策略。

接下來，利用SCENIC分析參與T細(xì)胞轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄因子 (Fig. 8E)，發(fā)現(xiàn)在NACT-ESCC中的CD8+?T細(xì)胞中ELF1、JUNB和FOSB上調(diào)，而在SA-ESCC中，這些TF下調(diào) (Fig. 8E)。有趣的是，LAG3和HAVCR2與T細(xì)胞活性相關(guān)，它們?cè)贜ACT-ESCC和SA-ESCC exhausted CD8+?T細(xì)胞中均高表達(dá) (Fig. 8F)。這些發(fā)現(xiàn)表明SA-ESCC和NACT- ESCC的免疫治療反應(yīng)具有顯著的異質(zhì)性。

Figure 8.?SA-ESCC和NAT-ESCC中CD8+?T細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜

文章結(jié)論

這篇文獻(xiàn)的作者通過對(duì)ESCC患者術(shù)前是否接受NACT治療的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，全面研究了NACT-ESCC和SA-ESCC來源的上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞的異質(zhì)性，并探討了是否接受NACT治療的腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)不同治療手段細(xì)胞組成的多樣性及分子復(fù)雜性，并提出了ESCC治療的新靶點(diǎn)，為未來ESCC的治療提供重要的參考。

參考文獻(xiàn)

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單細(xì)胞技術(shù)支持部?? 撰文

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