寫在前面

? ? 怎么說呢，這個系列就是把自己的homework拿出來曬一曬，也就是圖一樂丟人現(xiàn)眼一下，因為本人能力和知識范圍有限，難免會有錯誤，請諒解一下，也就是僅供參考。引文都有標注，如果有侵權(quán)的可以聯(lián)系我。歡迎各位大佬多交流，提問題、指錯誤。要是能關(guān)注一波那就更好了！

關(guān)于冷凍電子顯微鏡技術(shù)發(fā)展的思考

——The Resolution Revolution閱讀心得

1 ?冷凍電子顯微鏡

冷凍電子顯微鏡技術(shù)，簡稱冷凍電鏡(cryo-electron ?microscopy，cryo- EM），指在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，它與另外兩種技術(shù)：X射線晶體學(xué)(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)一起構(gòu)成了高分辨率結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，在獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)并揭示其功能方面起到了極為重要的作用。[1]

1.1?冷動電鏡的原理

冷凍電鏡的基本原理就是把樣品冷凍然后保持低溫放進顯微鏡里，利用電子作為光源對分子樣品進行測量，透過樣品和附近的冰層，透鏡系統(tǒng)把散射信號轉(zhuǎn)換為放大的圖像在探測器上記錄下來，最后進行信號處理，得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。[1]

1.2?冷凍電鏡的發(fā)展

??電子顯微三維重構(gòu)技術(shù)起源于1968年，D.J.De Rosier和Aaron Klug在Nature上發(fā)表了一篇關(guān)于利用電子顯微鏡照片重構(gòu)T4噬菌體尾部三維結(jié)構(gòu)的著名論文，提出并建立了電子顯微三維重構(gòu)的一般概念和方法。為了降低高能電子對分子結(jié)構(gòu)的損傷，Kenneth A. Taylor和Robert M.Glaeser于1974年提出了冷凍電鏡技術(shù)，并將其用于實驗研究。在最近幾年里，冷凍電鏡技術(shù)有了革命性的進步，主要得益于三個方面的突破。首先是樣品制備，通過利用薄膜碳層甚至石墨烯等材料的加入使得可以用更薄的冰層包裹分子樣品來提高信噪比（SNR）。[1]

第二個突破是電子的探測技術(shù)，也就是電子探測器的發(fā)明。在300 keV電子的轟擊下，傳統(tǒng)的器件都會被高能量打壞，因此10年前，冷凍電鏡中普遍使用的CCD相機需要將電子打在探測器上變成光信號，再通過CCD把光信號轉(zhuǎn)成電信號后得到圖像，但是“電光—光電”轉(zhuǎn)換的過程卻降低了信噪比。直到2013年，程亦凡博士與David Agard把直接電子檢測相機（electron direct detection device，DDD）用于冷凍電鏡單顆粒電鏡圖像記錄才解決了這個問題。DDD可以直接記錄電子信號，無需進行電子-光學(xué)信號轉(zhuǎn)換，保持了原始信號的強度，降低了點擴散效應(yīng)。同時，冷凍電鏡圖像能夠被記錄為一堆電影幀，每個電影幀都在短時間內(nèi)被記錄。由于速度快，還能減少了樣品漂移產(chǎn)生的圖像模糊，提高電鏡圖像的分辨率。因此，用DDD紀錄的圖像分辨率高、信噪比高、信號強、讀出速度快，解決了一直限制cryo-EM發(fā)展中的兩個最困難的問題，使得許多生物大分子復(fù)合物可以以原子分辨率重建3D密度圖。[1-3]

第三個突破是計算能力的提高和軟件算法的進步。冷凍電鏡的模型重構(gòu)通常需要對幾萬甚至幾十萬張投影圖片進行分析、組裝和優(yōu)化。而這需要先進的計算資源配合有效的算法才能實現(xiàn)。[1]

1.3?冷凍電鏡的應(yīng)用

目前Cryo-EM可以進行單顆粒分析（SPA）、冷凍電子斷層掃描（cryo?ET）和微電子衍射（Micro?ED）等多種應(yīng)用。此處主要介紹進行單顆粒分析、冷凍電子斷層掃描兩種應(yīng)用。

1.3.1 冷凍電鏡單粒子法

冷凍電鏡單粒子法，又稱單顆粒分析（SPA, Single particle analysis），可以對具有對稱結(jié)構(gòu)的大分子進行研究，也適合于研究結(jié)構(gòu)不規(guī)則的大分子復(fù)合物，對于分子量的上限無太大限制，理論上>100kD的分子在成像技術(shù)能夠保證的情況下可以形成足夠的對比以進行圖像校正，而太小的分子則不容易進行圖像分析。[4][5]

1.3.2 冷凍電子斷層掃描

冷凍電子斷層掃描(cryo-electron tomography,cryo?ET)則可用來研究一定厚度的亞細胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，由于樣品厚度的限制，能看到500-1000nm左右厚度的結(jié)構(gòu)，也可以了解整個細胞不同層面的內(nèi)部結(jié)構(gòu).[4]

2關(guān)于冷凍電子顯微鏡技術(shù)的思考與展望

冷凍電子顯微鏡技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一個成熟的方法，應(yīng)用于各種復(fù)雜的生物分子體系的高分辨結(jié)構(gòu)研究。相比于其它蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的分析方法，快速冷凍的方法能使蛋白質(zhì)更接近生理狀態(tài)，同時，也能拜托對樣品均一化以及結(jié)晶化處理等要求和手段的依賴，使得可檢測的蛋白質(zhì)范圍大大擴展，通過不斷地技術(shù)迭代與硬件升級，不斷提高分辨率，優(yōu)化圖像的對比度，Cryo-EM應(yīng)該能更加廣泛的用于研究分子量極小的蛋白質(zhì)以及具有不規(guī)則形狀的復(fù)合物等，或許我們也可以對Cryo-EM進行改造或者擴展運用，例如，不依靠純化的蛋白質(zhì)溶液，依靠電子切片或斷層掃描等技術(shù)，直接觀察在細胞中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。此外，我們也應(yīng)該促進三種檢測技術(shù)的融合發(fā)展，使得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的測定得以更加快速精確，檢測范圍可以不斷擴大。從而增強我們對蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)及作用機制的理解。

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參考文獻：

[1]?黃嵐青,劉海廣.冷凍電鏡單顆粒技術(shù)的發(fā)展、現(xiàn)狀與未來[J].物理,2017,46(02):91-99.

[2]?https://zhuanlan.zhihu.com/p/562770178

[3]?Nordgren, T. The resolution revolution.?Nature?407, 462–463 (2000). https://doi.org/10.1038/35035186

[4]?https://news.antpedia.com/p/222227101.html

[5]?https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/electron-microscopy/life-sciences/protein-analysis.html

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