一、PCR原理和歷史

1983年，美國生物化學(xué)家Kary Mullis深夜開車回家時，突然有了靈感。他在一張收據(jù)的背面寫下了概念，最終使他在1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎的想法。這個概念很簡單：在實驗室的試管中復(fù)制在細胞中發(fā)生的DNA復(fù)制過程。其結(jié)果是一樣的：在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上產(chǎn)生新的互補DNA（cDNA）鏈。

Mullis將Sanger的DNA測序的基礎(chǔ)作為他的新技術(shù)的起點。他意識到，重復(fù)使用DNA聚合酶會引發(fā)連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致特定DNA片段的擴增。

1976年，他發(fā)現(xiàn)了一種恒溫DNA聚合酶，Taq，它是從溫泉中發(fā)現(xiàn)的水熱菌中分離出來的。在發(fā)現(xiàn)Taq聚合酶之前，分子生物學(xué)家已經(jīng)在嘗試優(yōu)化循環(huán)DNA擴增方案，但他們需要在每個循環(huán)中添加新的聚合酶，因為這種酶不能承受DNA變性所需的高溫。擁有一種熱穩(wěn)定的酶意味著他們可以多次重復(fù)擴增過程，而不需要在每個循環(huán)添加新鮮的聚合酶，使整個過程可以擴展，更有效率，更省時。

1985年，Science雜志首次描述了這種使用Taq聚合酶的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。

1993年，第一個經(jīng)FDA批準的PCR試劑盒投放市場。從那時起，PCR得到了穩(wěn)步和系統(tǒng)的改進。它已經(jīng)成為從法醫(yī)證據(jù)分析和診斷，到疾病監(jiān)測和基因工程的一個游戲規(guī)則的改變者。毫無疑問，它被認為是20世紀最重要的科學(xué)進步之一。

二、標準PCR實驗概述

PCR用于從被稱為模板DNA的起始材料復(fù)雜混合物中擴增出一個特定的DNA片段。樣品制備和純化方案取決于起始材料，包括樣品基質(zhì)和目標DNA的可及性。通常情況下，需要將DNA提純到它的最小擴增濃度。然而，PCR確實需要了解待擴增DNA片段（稱為目標DNA）側(cè)面的DNA序列信息。

從實用的角度來看，PCR實驗相對簡單，可以在幾個小時內(nèi)完成。一般來說，一個PCR反應(yīng)需要五個關(guān)鍵試劑：

待擴增DNA：也叫PCR模板或模板DNA。這種DNA可以是任何來源的，如基因組DNA（gDNA）、cDNA和質(zhì)粒DNA。

DNA聚合酶：所有PCR反應(yīng)都需要一種能在高溫下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是常用的一種，它能在70℃下以60個堿基/秒的速度結(jié)合核苷酸，并能擴增長達5kb的模板，因此它適用于標準的PCR，沒有特殊要求。新一代的聚合酶正在被設(shè)計來改善反應(yīng)性能。例如，有些聚合酶被設(shè)計成只在高溫下激活，以減少反應(yīng)開始時的非特異性擴增。其他的聚合酶則具有“校對”功能，例如，在克隆過程中，擴增序列與模板序列完全一致時，這種功能是非常重要的。

引物：DNA聚合酶需要一個簡短的核苷酸序列來指示它們需要啟動擴增的位置。在PCR中，這些序列被稱為引物，是單鏈DNA的短片段（大約15 ~ 30個堿基）。在設(shè)計PCR實驗時，研究人員要確定要擴增的DNA區(qū)域，并設(shè)計一對引物，一個在正向鏈上，一個在反向鏈上，專門針對目標區(qū)域的側(cè)翼。

引物設(shè)計是PCR實驗的一個關(guān)鍵部分，應(yīng)謹慎進行。引物序列的選擇必須以感興趣的獨特DNA為目標，避免與類似序列結(jié)合的可能性。它們應(yīng)該有相似的熔解溫度，因為退火步驟對兩條鏈來說是同時發(fā)生的。

引物的熔化溫度可能受到鳥嘌呤（G）或胞嘧啶（C）與腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）相比所占百分比的影響，較高的GC含量會提高熔化溫度。調(diào)整引物長度可以幫助在匹配引物對時補償這一點。避免形成二級結(jié)構(gòu)或引物二聚體的序列也很重要，因為這將降低PCR效率，有許多免費的在線工具可用于幫助設(shè)計引物。

脫氧核苷酸三磷酸酯（dNTPs）：這些作為合成DNA新鏈的構(gòu)件，包括四種基本的DNA核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。dNTPs通常以等摩爾量添加到PCR反應(yīng)中，以實現(xiàn)最佳的堿基結(jié)合。

PCR緩沖液：PCR緩沖液確保在整個PCR反應(yīng)中保持最佳條件。PCR緩沖液的主要成分包括氯化鎂（MgCl2）、?tris-HCI和氯化鉀（KCl）。氯化鎂作為DNA聚合酶的輔助因子，而tris-HCl和氯化鉀在反應(yīng)期間保持穩(wěn)定的pH值。

PCR反應(yīng)是通過將上述試劑加入到一個試管中，并將試管置于PCR儀中進行反應(yīng)。

PCR擴增包括三組確定的時間和溫度，稱為步驟：變性、退火和延伸（圖1）。

圖1 | 一個PCR循環(huán)的步驟

這些步驟中的每一個都被稱為循環(huán)，重復(fù)30 ~ 40次，每個循環(huán)的DNA數(shù)量翻倍，獲得擴增（圖2）。

讓我們仔細看一下每個步驟。

變性

PCR的第一步，稱為變性，將模板DNA加熱到95℃，持續(xù)幾秒鐘，隨著兩條DNA鏈之間的氫鍵迅速斷裂而分離。

退火

然后將反應(yīng)混合物冷卻30秒至1分鐘。退火溫度通常為50 ~ 65 ℃，然而，確切的最佳溫度取決于引物的長度和序列，每套新的引物都必須仔細優(yōu)化。

兩條DNA鏈可以在這個溫度下重新結(jié)合，但大多數(shù)不會，因為混合物中含有大量過量的引物，它們在特定的互補位置與模板DNA結(jié)合，或退火。一旦退火步驟完成，模板DNA和引物之間將形成氫鍵。這個時候，聚合酶已經(jīng)準備好擴展DNA序列。

延伸

然后將溫度提高到混合物中存在的DNA聚合酶理想工作溫度，通常在72℃左右，如果是Taq，則為74℃。

DNA聚合酶附著在每個引物的一端，合成新的DNA鏈，與模板DNA互補?，F(xiàn)在我們有四條DNA鏈，而不是一開始就有的兩條。

溫度回升到94℃，雙鏈DNA分子，其中包括“原始”分子和新合成的分子，再次變性為單鏈。這就開始了變性-退火-延伸的第二個循環(huán)。在這第二個循環(huán)結(jié)束時，有8個單鏈DNA分子。通過重復(fù)30次循環(huán)，開始時存在的雙鏈DNA分子被轉(zhuǎn)化為超過1.3億個新的雙鏈分子，每個分子都是由兩個引物的退火點劃定起始分子區(qū)域的副本。

為了確定擴增是否成功，PCR產(chǎn)物可以通過凝膠電泳進行可視化，顯示擴增子的存在/不存在、大小和大致豐度。根據(jù)應(yīng)用和研究問題，這可能是一個實驗的終點，例如，如果確定一個基因是否存在。否則，PCR產(chǎn)物可能只是更復(fù)雜的下游調(diào)查（如測序和克?。┑钠瘘c。

不同類型的PCR

由于其多功能性，PCR技術(shù)近年來不斷發(fā)展，導(dǎo)致了幾種不同類型的PCR技術(shù)的發(fā)展。

一些最廣泛使用的是：

定量實時PCR（qPCR）

最有用的發(fā)展之一是定量實時PCR或qPCR。顧名思義，qPCR是一種定量技術(shù)，可以實時監(jiān)測擴增過程并在擴增過程中檢測PCR產(chǎn)物[2]。

它可以用來確定目標DNA的起始濃度，在許多情況下可以忽略凝膠電泳的需要。這要歸功于加入了非特異性的熒光插層染料，如SYBR? Green，它與雙鏈DNA結(jié)合后會發(fā)出熒光，或DNA寡核苷酸序列特異性的熒光探針，如水解（TaqMan）探針和分子信標。

探針與擴增子內(nèi)的DNA目標序列特異性結(jié)合，并利用福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的原理，通過一端的熒光分子和另一端的淬滅劑的耦合產(chǎn)生熒光。對于熒光染料和探針來說，隨著目標DNA拷貝數(shù)的增加，熒光水平也按比例增加，從而可以參照含有已知拷貝數(shù)的標準對擴增進行實時定量（圖3）。

圖3 | qPCR擴增圖和標準曲線示例，用于對未知樣本的拷貝數(shù)進行量化。

qPCR使用配備有熒光檢測系統(tǒng)的專用PCR儀，在擴增過程中監(jiān)測熒光信號。

反轉(zhuǎn)錄-PCR （RT-PCR）

反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR和RT-qPCR是兩種常用的PCR變體，能夠在臨床和研究環(huán)境中進行基因轉(zhuǎn)錄分析和病毒RNA的定量。

RT是用單鏈模板RNA制作cDNA的過程[3]，因此也被稱為第一鏈cDNA合成。RT-PCR的第一步是在RNA模板和DNA寡核苷酸引物之間合成一個DNA/RNA雜交體。催化這一反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶具有RNase活性，然后降解雜交體的RNA部分。隨后，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶活性合成一個單鏈DNA分子。高純度和高質(zhì)量的起始RNA對于成功的RT-PCR是至關(guān)重要的。

RT-PCR可以按照兩種方法進行：一步RT-PCR和兩步RT-PCR。在第一種情況下，RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)發(fā)生在同一試管中，而在兩步RT-PCR中，這兩個反應(yīng)是分開的，并依次進行。

反轉(zhuǎn)錄-定量PCR（RT-qPCR）

上述反轉(zhuǎn)錄也經(jīng)常作為qPCR的第一步，對生物樣品中的RNA進行定量（無論是RNA轉(zhuǎn)錄本還是來自病毒RNA基因組）。

與RT-PCR一樣，有兩種通過RT-qPCR量化RNA的方法：一步RT-qPCR和兩步RT-qPCR。在這兩種情況下，RNA首先被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為qPCR擴增的模板。在兩步法中，逆轉(zhuǎn)錄和qPCR擴增作為兩個獨立的實驗依次進行。在一步法中，RT和qPCR在同一管中進行。

數(shù)字PCR（dPCR）和數(shù)字滴定PCR（ddPCR）

數(shù)字PCR（dPCR）是原始PCR方案的另一種修改版[4]。與qPCR一樣，dPCR技術(shù)使用DNA聚合酶，利用引物組和探針從復(fù)雜的樣品中擴增目標DNA。不過，主要的區(qū)別在于PCR反應(yīng)的分區(qū)和最后的數(shù)據(jù)采集。

dPCR和ddPCR是基于限制性稀釋的概念。PCR反應(yīng)被分割成大量納升體積的子反應(yīng)（分區(qū)）。PCR擴增是在每個液滴內(nèi)進行的。在PCR之后，用泊松統(tǒng)計學(xué)對每個液滴進行分析，以確定PCR陽性液滴在原始樣品中的百分比。

一些分區(qū)可能包含一個或多個目標拷貝，而其他分區(qū)可能不包含目標序列。因此，分區(qū)分類為陽性（檢測到目標）或陰性（未檢測到目標），為數(shù)字輸出格式提供基礎(chǔ)。

ddPCR是最近的一項技術(shù)，在2011年開始使用[5]。ddPCR利用水油乳劑形成分隔模板DNA分子的分區(qū)。這些液滴基本上充當獨立的試管，PCR反應(yīng)就在其中進行。

微流控PCR

帶有微通道和微室的微流控處理系統(tǒng)最近的發(fā)展為一系列的實際應(yīng)用鋪平了道路，包括在微流控芯片上通過PCR擴增DNA。

在芯片上進行的PCR得益于微流控技術(shù)在速度、靈敏度和試劑低消耗方面的優(yōu)勢。這些特點使微流控PCR對POCT特別有吸引力，例如，用于診斷應(yīng)用。從實用的角度來看，樣品流經(jīng)一個微流控通道，反復(fù)通過反映PCR不同步驟的三個溫度區(qū)。10 μL的樣品進行20個PCR循環(huán)只需要90秒[6]。隨后的分析可以很容易地在片外進行。

PCR故障排除

不同的PCR方法都有優(yōu)點和缺點，對它們所適合的應(yīng)用產(chǎn)生影響[7]。表1總結(jié)了這些優(yōu)點。

表1 | 不同PCR方法的主要優(yōu)點和缺點

PCR的應(yīng)用

PCR已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中不可缺少的工具，并完全改變了科學(xué)研究。該技術(shù)還為分子生物學(xué)領(lǐng)域以外的人打開了細胞和分子過程的研究，因此也被許多學(xué)科的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了用途。

雖然PCR本身是一種強大的獨立技術(shù)，但它也被納入了更廣泛的技術(shù)，如克隆和測序，作為這些工作流程中一個小而重要的部分。

PCR的研究應(yīng)用包括：

基因轉(zhuǎn)錄

PCR可以檢查特定時間點上細胞類型、組織和生物體之間基因轉(zhuǎn)錄的變化。在這個過程中，RNA從感興趣的樣品中分離出來，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，特定基因的原始RNA水平可以從PCR中擴增的cDNA數(shù)量中進行量化。

基因分型

PCR可以檢測特定細胞或生物體的等位基因的序列變化。一個常見的例子是對轉(zhuǎn)基因生物體進行基因分型，如基因敲除和基因敲入小鼠。在這種應(yīng)用中，引物被設(shè)計用來擴增轉(zhuǎn)基因部分（在轉(zhuǎn)基因動物中）或突變部分（在突變動物中）。

克隆和誘變

PCR克隆是一種廣泛使用的技術(shù)，通過PCR擴增的雙鏈DNA片段被插入載體（如gDNA、cDNA、質(zhì)粒DNA）。例如，這使得創(chuàng)建的細菌菌株的遺傳物質(zhì)被刪除或插入。定點誘變也可用于通過克隆引入點突變。這通常采用一種被稱為重組PCR的技術(shù)，其中重疊的引物被專門設(shè)計來納入堿基替換（圖4）。這種技術(shù)也可用于創(chuàng)造新的基因融合。