2023年4月6日，山東第一醫(yī)科大學(xué)宋國華課題組在Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 雜志（IF=10.514）發(fā)表題為“Sleep Deprivation Promotes Endothelial Inflammation and Atherogenesis by Reducing Exosomal miR-182-5p”的研究論文，該研究報道了在睡眠剝奪和動脈粥樣硬化的背景下由外泌體介導(dǎo)的小腸上皮-動脈通訊，并通過多組學(xué)揭示了 miR-182-5p 在睡眠剝奪后誘導(dǎo)動脈粥樣硬化形成和進(jìn)展中的重要作用，闡明了代謝性心血管疾病發(fā)展的潛在機(jī)制。

期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology

影響因子：10.514

涉及的服務(wù)產(chǎn)品：轉(zhuǎn)錄組測序

睡眠不足是現(xiàn)代24小時社會普遍存在的突出問題。有統(tǒng)計表明近一半的成年人每天的睡眠時間少于建議的7至8小時。睡眠不足會增加患糖尿病、癌癥、肥胖和心血管疾病 (CVD)的風(fēng)險。觀察性前瞻性隊列研究表明，睡眠時間短和睡眠片段化與亞臨床多區(qū)域動脈粥樣硬化風(fēng)險增加獨立相關(guān)。動脈粥樣硬化被認(rèn)為是一種慢性炎癥代謝性疾病，由血管內(nèi)皮處脂質(zhì)異常堆積和炎性細(xì)胞浸潤引起。有相關(guān)文獻(xiàn)報道動脈粥樣硬化發(fā)生的第一步是內(nèi)皮損傷和功能障礙，并用臨床證據(jù)和實驗數(shù)據(jù)證明了睡眠障礙、內(nèi)皮功能障礙和 CVD 之間存在密切聯(lián)系，其具體潛在機(jī)制仍有待闡明。小片段RNA具有重要的結(jié)構(gòu)、催化和調(diào)控作用功能，并可能影響許多蛋白質(zhì)編碼基因的輸出。miRNA作為外泌體的重要載體，最近已成為參與包括心血管疾病在內(nèi)的各種疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，目前關(guān)于miRNA在對睡眠調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化形成的分子機(jī)制知之甚少。

本研究從睡眠剝奪或睡眠未剝奪的志愿者、睡眠剝奪12周的小鼠或同窩對照的血漿中分離循環(huán)外泌體，進(jìn)行miRNA芯片以確定循環(huán)外泌體中miRNA表達(dá)的變化，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探討了循環(huán)外泌體在睡眠剝奪狀態(tài)下內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化形成中的潛在分子機(jī)制。研究結(jié)果揭示了一種新的內(nèi)源性促動脈粥樣硬化機(jī)制，即慢性睡眠剝奪衍生的循環(huán)外泌體通過miR-182-5p 促進(jìn)內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化形成。

Result1 ?十二周的睡眠剝奪加重了?apoE?/??小鼠的動脈粥樣硬化

本研究對易患動脈粥樣硬化的?apoE-/-?小鼠進(jìn)行 12 周的慢性睡眠剝奪（SD）。結(jié)果顯示，體重、血漿總膽固醇 (TC)、甘油三酯和血壓沒有變化；與對照組相比，小鼠的動脈粥樣硬化病變逐漸變大，12周的睡眠剝奪加重了動脈粥樣硬化。

圖1 ?高脂飲食對apoE-/-小鼠睡眠剝奪的評估

Result2 ?睡眠剝奪后小鼠和人類血漿外泌體的表征和體外功能驗證

為了詳細(xì)說明睡眠剝奪后小鼠和人類血漿外泌體的功能，本研究從睡眠剝奪小鼠 (SD) 和睡眠控制小鼠 (SC) 的血漿中分離外泌體，納米粒子追蹤分析顯示 SC-exo 和 SD-exo 之間的粒徑分布或血漿濃度沒有顯著差異。進(jìn)一步用 PKH67 標(biāo)記的外泌體孵育培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)，觀察到外泌體在孵育 12 小時后被 HUVEC 內(nèi)化。隨后，該團(tuán)隊還評估了 SC-exo 和 SD-exo 對 ox-LDL （氧化低密度脂蛋白）或脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低；內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、IL-1β 和 IL-18 的釋放增加。重要的是，還發(fā)現(xiàn) SC-exo 保護(hù)細(xì)胞免受 ox-LDL 或 LPS 誘導(dǎo)的損傷，而 SD-exo 則失去了這種保護(hù)作用。

此外，該團(tuán)隊還探索了睡眠剝奪對人類循環(huán)外泌體的影響。上夜班工作1年以上的健康女護(hù)士7名（曾在深夜工作≥3小時）為實驗組，并招募了 8 名女性作為對照組。與對照組相比，夜間工作者增加了 ox-LDL 或 LPS 處理的 HUVEC 中 IL-1β 和 IL-18的釋放。結(jié)果表明睡眠剝奪衍生的血漿外泌體在 ox-LDL 或 LPS 損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮促炎和促凋亡作用。

圖2 | 睡眠不足小鼠和人類血漿外泌體的功能驗證

Result3 ?注射睡眠剝奪衍生的循環(huán)外泌體增加動脈粥樣硬化斑塊面積并增強(qiáng)?apoE-/-?小鼠主動脈的炎癥

為了進(jìn)一步了解睡眠剝奪者衍生外泌體（SD-exo ）在體內(nèi)的促炎和動脈粥樣硬化促進(jìn)作用，該團(tuán)隊將SD-exo或SC-exo從野生型C57BL/6J小鼠的血漿中分離出來，腹膜內(nèi)注射到?apoE-/-?小鼠中，結(jié)果顯示SC-exo治療可顯著降低整個主動脈和主動脈弓中動脈粥樣硬化斑塊的數(shù)量和大小，SD-exo治療則可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。組織學(xué)分析顯示，SD-exo 治療小鼠的病變、巨噬細(xì)胞和膠原蛋白明顯增多，并且與 IL-18 和 IL-1β 相關(guān)的炎癥表型在 SD-exo 處理后的小鼠主動脈組織中顯著上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，與 SC-exos 相比，SD-exos 具有促炎和促動脈粥樣硬化作用。

圖3 | 睡眠剝奪小鼠血漿中分離出的外泌體增加了動脈粥樣硬化斑塊面積并增強(qiáng)?apoE-/-?小鼠主動脈的炎癥

Result4 ?miR-182-5p 是 SD-Exo 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵成分

為了確定SD-exo促炎作用的成分，本研究采用miRNA芯片進(jìn)行了SD-exo和SC-exo的miRNA差異分析。結(jié)果共檢測到14種差異表達(dá)的miRNA（FC>2.0；P<0.05），并且發(fā)現(xiàn)miR-182-5p抑制劑顯著降低了用ox-LDL和SC-exo處理的HUVEC中的細(xì)胞活力，增加了細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)了IL-18和IL-1β的釋放。為了更好地了解外泌體miR-182-5p的功能，課題組評估了用血漿外泌體處理的HUVEC中miR-182-5p的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD-exo孵育48小時的HUVEC中miR-182-5p水平顯著降低。此外，miR-182-5p的加入顯著減弱了SD-exo的促炎和促凋亡作用。值得注意的是，本課題組還研究了慢性睡眠剝奪是否會降低人類受試者的血漿外泌體miR-182-5p。結(jié)果顯示，夜班護(hù)士在夜班工作1年后的血漿外泌體miR-182-5p水平下降了1.9倍，miR-182-5p的添加顯著減弱了夜班外泌體的促炎作用。綜合來看，這些結(jié)果都表明miR-182-5p在SD-exo誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和凋亡中起著關(guān)鍵作用。

圖4 | miR-182-5p 的減少對于睡眠剝奪衍生的循環(huán)外泌體提供的促炎作用至關(guān)重要

Result5 ?miR-182-5p 通過靶向內(nèi)皮細(xì)胞中的 MYD88 發(fā)揮抗炎作用

為進(jìn)一步了解miR-182-5p的作用，該研究團(tuán)隊用ox-LDL處理HUVEC 12小時，隨后SC-exo或SD-exo處理12小時，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序?；诳赡艿?miR-182-5p 靶基因和內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，最終聚焦于參與炎癥和細(xì)胞凋亡途徑的 MYD88，并發(fā)現(xiàn) miR-182-5p 模擬物顯著降低了 MYD88蛋白水平，而 miR-182-5p 抑制劑增加了 HUVEC 中的 MYD88。同時，NF-?B 的磷酸化和 MYD88 的 2 個下游基因 NLRP3 的表達(dá)被 miR-182-5p 模擬物降低并被 miR-182-5p 抑制劑升高。此外，通過 siRNA 沉默下調(diào) MYD88 蛋白顯著降低了 HUVEC 中 ox-LDL 誘導(dǎo)的 IL-18 和 IL-1β 的釋放，這些結(jié)果進(jìn)一步表明 miR-182-5p 通過靶向內(nèi)皮細(xì)胞中的 MYD88 發(fā)揮抗炎作用。

圖5 | MYD88是miR-182-5p在內(nèi)皮細(xì)胞中的靶基因

Result6? 睡眠剝奪狀態(tài)下外泌體miR-182-5p水平的降低與小腸上皮有關(guān)

Result6.1 睡眠剝奪使小腸上皮細(xì)胞miR-182-5p的表達(dá)減少

為了探索睡眠剝奪誘導(dǎo)的循環(huán)外泌體miR-182-5p減少的起源，本研究檢測了成熟miR-182-5p及其前體pre-miR-182-5p的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在 8 周睡眠剝奪后，腸道、骨骼肌和主動脈中的成熟 miR-182-5p 和 pre-miR-182-5p 均顯著降低，并且8 周的睡眠剝奪不僅減少了小腸上皮細(xì)胞中的成熟和前體miR-182-5p，而且還減少了 SIE 衍生的外泌體中的 miR-182-5p。

圖6.1 | 睡眠剝奪使小腸上皮細(xì)胞miR-182-5p的表達(dá)減少

Result6.2 睡眠剝奪引起的褪黑激素減少可能導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞中 miR-182-5p 表達(dá)下調(diào)

為了研究褪黑激素對 miR-182-5p 產(chǎn)生的作用，將培養(yǎng)的人腸上皮細(xì)胞暴露于褪黑激素，發(fā)現(xiàn)褪黑激素增加了人腸上皮細(xì)胞中的成熟和前體miR-182-5p，還增強(qiáng)了人腸上皮細(xì)胞外泌體 miR-182-5p的分泌。此外，體內(nèi)研究也顯示睡眠剝奪小鼠的血漿褪黑激素水平降低。有趣的是，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪誘導(dǎo) ROS 在腸道中積累，并且給予褪黑激素可以減輕睡眠剝奪小鼠的氧化應(yīng)激，表明ROS可能在褪黑激素提供的miR-182-5p產(chǎn)生中發(fā)揮作用。

圖6.2 | 睡眠剝奪引起的褪黑激素減少可能導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞中 miR-182-5p 表達(dá)下調(diào)

Result7? miR-182-5p的減少在睡眠剝奪誘導(dǎo)的體內(nèi)動脈粥樣硬化中是必要的

為了探索 miR-182-5p 在體內(nèi)睡眠剝奪誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化形成中的作用。該團(tuán)隊將睡眠剝奪的?apoE-/-?小鼠用特異性模擬 miR-182-5p 功能的 miR-182-5p agomiR 治療，發(fā)現(xiàn)注射 agomiR 增加了 SIE 中的 miR-182-5p 表達(dá)。與體外結(jié)果一致，在 agomiR 處理后小鼠主動脈組織中炎癥表型，包括 MYD88、NLRP3、IL-1β 和 IL-18的表達(dá)減少。重要的是，與對照組相比，agomiR 治療顯著降低了整個主動脈和主動脈弓中動脈粥樣硬化斑塊的數(shù)量和大小。綜上所述，這些結(jié)果揭示了 miR-182-5p 在睡眠剝奪誘導(dǎo)的?apoE-/-?小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成和進(jìn)展中的重要作用。

圖7 | miR-182-5p的減少對睡眠不足誘導(dǎo)的斑塊形成至關(guān)重要

本研究報告了循環(huán)外泌體通過 MYD88/NF-?B/NLRP3 通路的 miRNA 依賴性上調(diào)參與睡眠剝奪引起的動脈粥樣硬化。揭示了在睡眠剝奪和動脈粥樣硬化的背景下由外泌體介導(dǎo)的小腸上皮-動脈通訊。證實了循環(huán)外泌體及其包含的 miRNA 可能是動脈粥樣硬化發(fā)展的有前途的模仿睡眠剝奪的候選者，闡明了代謝性心血管疾病發(fā)展的潛在機(jī)制。

【參考文獻(xiàn)】

Li, Xiao, et al. Sleep Deprivation Promotes Endothelial Inflammation and Atherogenesis by Reducing Exosomal miR-182-5p. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, 10.1161/ATVBAHA.123.319026. 6 Apr. 2023, doi:10.1161/ATVBAHA.123.319026