概括

狗的獨(dú)特顏色圖案是犬類多樣性的一個組成部分。顏色模式差異被認(rèn)為是由狼馴化期間和之后的突變和人工選擇引起的，但在理解這些模式如何進(jìn)化和遺傳控制方面仍存在重要差距。在其他哺乳動物中，ASIP基因的變異控制著黃色和黑色色素的時間和空間分布。在這里，我們確定了腹側(cè)和毛發(fā)周期ASIP的獨(dú)立調(diào)節(jié)模塊表達(dá)，我們描述了它們的行為和進(jìn)化起源。結(jié)構(gòu)變異為每個調(diào)節(jié)模塊定義了多個等位基因，并以不同的方式組合以解釋五種不同的狗顏色模式。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，其中一種模式的單倍型組合與北極白狼共享，其毛發(fā)周期特異性模塊可能起源于 200 萬多年前與灰狼分離的已滅絕犬科動物。更新世期間對較輕外套的自然選擇為狗和狼的廣泛顏色變異提供了遺傳框架。

主題

家犬驚人的形態(tài)多樣性的一個核心方面是它們的顏色和顏色模式。在許多哺乳動物中，特定的顏色模式是通過AGouti?(?ASIP?)的差異調(diào)節(jié)產(chǎn)生的， ASIP編碼旁分泌信號分子和黑皮質(zhì)素 1 受體 (MC1R) 的拮抗劑，導(dǎo)致毛囊黑色素細(xì)胞從制造真黑色素（黑色或棕色色素）轉(zhuǎn)變?yōu)楹趾谒兀S色至近白色色素）1?,?2?,?3?,?4。在實(shí)驗(yàn)室小鼠中，Asip表達(dá)由特定身體區(qū)域和毛發(fā)生長期間的特定時間的替代啟動子控制，并產(chǎn)生輕腹刺鼠表型，腹側(cè)毛發(fā)為黃色，背側(cè)毛發(fā)包含黑色和黃色色素的混合物4。ASIP的遺傳變異影響許多哺乳動物的顏色模式；然而，在狗中，這種情況仍未得到解決，這在很大程度上是由于不同模式類型的復(fù)雜性、與其他基因座變異的上位關(guān)系以及區(qū)分一個或多個變異的遺傳關(guān)聯(lián)是否真正代表因果變異或只是密切聯(lián)系的挑戰(zhàn)5?.

在這里，我們研究了ASIP調(diào)節(jié)模塊中的非編碼變異及其對家犬模式表型的影響。我們將我們的分析擴(kuò)展到包括現(xiàn)代和古代野生犬科動物，并揭示進(jìn)化史，其中更新世期間的自然選擇為今天的顏色圖案多樣性提供了分子基質(zhì)。

結(jié)論

ASIP的表達(dá)促進(jìn)褐黑素的合成；因此，與黃色相關(guān)的ASIP等位基因?qū)εc黑色相關(guān)的等位基因占優(yōu)勢。雖然顯性黃色 (DY) 在來自不同地理位置的狗中很常見，但現(xiàn)代狼最常見的毛皮圖案是刺鼠 (AG)?6，其中背部有帶狀毛發(fā)，腹部較輕。另外三種顏色模式是可識別的，但在基因組分析之前，所有這些顏色模式在歷史上都被不同的、不一致的、有時重疊的名稱描述過；我們將它們稱為陰影黃色（SY），黑色鞍形（BS）和黑色背（BB）（圖1和補(bǔ)充表1）。

左側(cè)顯示了由ASIP監(jiān)管變化引起的五種模式類型的圖紙，右側(cè)顯示了代表性照片。未顯示由ASIP功能喪失的純合子引起的完全黑色涂層。在每種圖案類型中，可能會因其他因素而有所不同，包括： (1) 褐黑色和真黑色區(qū)域之間邊界的位置，例如黑色馬鞍形或黑色背面；(2) 褐黑素的陰影（紅色至近白色）；(3) 存在由非ASIP基因引起的黑色面膜或白色斑點(diǎn)；(4) 被毛的長度和/或卷曲。模式按優(yōu)勢順序顯示。

我們分析了可從具有顯性黃色和黑色背部圖案的狗獲得的皮膚 RNA 測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)，并確定了狗ASIP的三個替代非翻譯第一外顯子（圖2a、擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1和補(bǔ)充表2）。如下所述，三個轉(zhuǎn)錄本中的兩個在顯性黃色和黑色背狗之間的豐度不同，并且相應(yīng)的 5'-側(cè)翼啟動子具有與狗模式表型相關(guān)的序列變異。這兩個轉(zhuǎn)錄本的 5' 側(cè)翼啟動子區(qū)域與實(shí)驗(yàn)室小鼠的腹側(cè)啟動子 (VP) 和毛發(fā)周期啟動子 (HCP) 直系同源4；然而，我們的遺傳分析（圖2) 揭示了狗的 VP 和 HCP 產(chǎn)生了比老鼠更復(fù)雜的模式。與位于 VP 上游約 16 kb 的第三個啟動子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本（圖2b）在我們的數(shù)據(jù)集中沒有變化。

a，基因組上下文（NCBI 注釋版本 105，CanFam3.1 程序集）。藍(lán)色數(shù)字表示先前報道的變體關(guān)聯(lián)——i（參考文獻(xiàn)16）、ii（參考文獻(xiàn)32）和 iii（參考文獻(xiàn)17）——在討論和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2中提到。b、犬ASIP基因具有三個替代啟動子和 5'-非編碼外顯子（核苷酸坐標(biāo)表示它們的 3'-末端。腹側(cè)和毛發(fā)周期特異性啟動子的 1.5-kb 部分內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異解釋了狗的五種不同顏色模式。兩種不同的VP 單倍型和五種不同的 HCP 單倍型示意性表示。星號表示與ASIP模式變異無關(guān)的第三個啟動子和非編碼外顯子，如文中所述和圖1.c，擴(kuò)展單倍型組合如何相關(guān)的總結(jié)用一個或兩個箭頭表示半定量ASIP表達(dá)水平，或用 X 表示無表達(dá)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1）。

為了更好地理解啟動子使用和模式表型之間的關(guān)系，我們檢查了來自 77 個具有已知顏色模式的狗和狼樣本的全基因組序列數(shù)據(jù)（補(bǔ)充表3）。我們使用在ASIP基因座純合的狗來推斷兩種 VP 單倍型和五種 HCP 單倍型，由位于每個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 1.5 kb 內(nèi)的多個結(jié)構(gòu)變體組成。VP1 包含一個相對于ASIP轉(zhuǎn)錄反向的 SINE 元件和在 VP2 中未發(fā)現(xiàn)的富含 A 的擴(kuò)展（左圖2b和補(bǔ)充表1）；五個 HCP 單倍型根據(jù) SINE 元素的數(shù)量和身份而有所不同，都在相同的方向ASIP以及額外的插入和刪除（圖2b右和補(bǔ)充表1）。所有結(jié)構(gòu)變體都用 Sanger 測序精確描繪。

通過為 VP 和 HCP 結(jié)構(gòu)變體開發(fā)基于 PCR 的基因分型分析，這些結(jié)果得到擴(kuò)展，檢查它們與來自 34 個品種的 352 只狗的不同模式表型的關(guān)聯(lián)，并將這些結(jié)果與先前發(fā)表的變體進(jìn)行比較（表1，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2和補(bǔ)充表1和4-7）。如圖2c和表1所示，VP1 或 VP2 與 HCP1、2、3、4 或 5 的雙倍型組合與ASIP模式表型的變化完全相關(guān)。例如，VP1-HCP1、VP2-HCP1、VP2-HCP2 的純合子分別是顯性黃色、陰影黃色和刺鼠（補(bǔ)充表4?-?7?)。黑鞍犬和黑背犬的 VP 配置不同，但都攜帶純合或復(fù)合雜合配置的 HCP3、4 和/或 5。由于ASIP活性的高低與黃色素的產(chǎn)生量直接相關(guān)，這些遺傳關(guān)聯(lián)結(jié)果表明VP1的活性大于VP2，HCP1的活性大于HCP2和HCP3，4和5都代表功能喪失，因?yàn)?HCP4 單倍型包括毛發(fā)周期第一外顯子的大量缺失（圖2b）并且不能補(bǔ)充 HCP3 或 HCP5（圖3和補(bǔ)充表6 ））。重要的是，與黑色背表型相比，腹側(cè)啟動子（VP1 與 VP2）的活性增加與黑色馬鞍中黃色素的背側(cè)擴(kuò)張相關(guān)（圖1和2c），這表明 VP 和 HCP 單倍型彼此獨(dú)立發(fā)揮作用。

描述不同 VP 和 HCP 單倍型的結(jié)構(gòu)變異與ASIP轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系在來自背側(cè)和腹側(cè)狗皮膚活檢的 RNA-seq 數(shù)據(jù)中進(jìn)行了更直接的探索（補(bǔ)充表8和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1）。RNA-seq 數(shù)據(jù)的讀取計數(shù)與遺傳關(guān)聯(lián)結(jié)果的預(yù)期一致：VP1 具有更大的轉(zhuǎn)錄活性，并且相對于 VP2（僅在腹側(cè)表達(dá)）在空間上變寬，HCP1 相對于 HCP2 具有更大的轉(zhuǎn)錄活性，并且沒有讀取從 HCP3 或 4 中檢測到（圖2b和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1）?？傊@些結(jié)果為ASIP提供了分子解釋狗的模式變異，其中 VP 和 HCP 獨(dú)立發(fā)揮作用，并且與 VP 和 HCP 非常接近的結(jié)構(gòu)變異調(diào)節(jié)啟動子活性。

通過比較 18 只純合狗的單倍型（VP 和 HCP 的結(jié)構(gòu)變體和編碼序列）與 10 只當(dāng)代灰狼的單倍型（圖4a和補(bǔ)充表9 ）來檢查變體ASIP調(diào)節(jié)模塊之間的遺傳關(guān)系?？傮w而言，刺鼠狗的單倍型與灰狼的相似。然而，占主導(dǎo)地位的黃色和在較小程度上陰影黃色狗的單倍型與來自埃爾斯米爾島和格陵蘭的北極灰狼相似，那里所有的狼都是白色的（圖4a-c）。值得注意的是，狼的白色毛皮顏色代表蒼白的褐黑素，如 Kermode 熊或雪鞋野兔7?,?8.?在包含 VP、HCP 和編碼序列的 64-kb 片段中，北極灰狼單倍型除了一個多態(tài)性位點(diǎn)外是相同的（圖4a，chr24：23,337,523），并且與狗顯性黃色單倍型的區(qū)別僅在于六個單核苷酸變體（SNV）（補(bǔ)充表10）。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明，在沒有最近的基因交換的情況下，狗的主要黃色和狼的白色毛色的共同起源。

a ，灰狼和狗（行）中ASIP基因座的 377 個 SNV（列）的基因型，編碼為雜合性（淺藍(lán)色）、參考純合性（黃色）或替代（深藍(lán)色）等位基因或缺失基因型（白色的）。包括備用的第一個外顯子（箭頭）和附近的 DY 相關(guān)結(jié)構(gòu)變體（正弦插入，綠色；多核苷酸擴(kuò)展，橙色）以供參考。b，最大似然系統(tǒng)發(fā)育，包括七個現(xiàn)存的犬科動物物種和狗，分別來自 HCP 上游或下游的 48 和 16 kb 間隔?；依?狗的進(jìn)化枝用方框突出顯示，表示與全基因組系統(tǒng)發(fā)育一致（藍(lán)色）或不一致（紅色）的關(guān)系。C, 灰狼、北極灰狼和藏狼的圖像。d，代表不同 HCP 進(jìn)化歷史的系統(tǒng)發(fā)育，從現(xiàn)存犬科動物的遺傳變異中推斷出來。結(jié)構(gòu)變體（如圖2所示）和衍生的 SNV（青色）區(qū)分狼樣犬科動物（藍(lán)色）、幽靈譜系（紅色）和基礎(chǔ)犬科動物（黑色）單倍型。

通過為狗、狼和另外八種犬科動物構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步探索了ASIP單倍型的進(jìn)化起源（補(bǔ)充表9）?；?SNV 頻率的差異，48-kb VP 片段與 16-kb HCP-外顯子 2/3/4 片段分開考慮（補(bǔ)充信息和圖4a）。在 VP 樹中，所有的狗和灰狼形成一個單一的進(jìn)化枝，與已知的物種關(guān)系9一致。然而，在 HCP 樹中，占優(yōu)勢的黃色和陰影黃色狗與北極灰狼一起處于一個單獨(dú)的進(jìn)化枝中；值得注意的是，這個進(jìn)化枝是金豺的基礎(chǔ)，與其他犬科動物不同（圖4b和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖。3和4?)。

衍生等位基因共享的模式提供了額外的見解（圖4d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5）。如圖所示。如圖2c和4d所示，HCP2 的特征在于所有犬科動物共有的三個小的重復(fù)元素，因此是祖先形式。在通向核心類狼犬科動物（金豺、土狼、埃塞俄比亞狼和灰狼）的分支中，HCP2-外顯子 2/3/4 片段內(nèi)有九個衍生的 SNV 等位基因（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5和補(bǔ)充表11），其中四個位于靠近 HCP2 的重復(fù)元素的側(cè)面（圖4d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5）。九個衍生的等位基因中沒有一個存在于主要的黃色 HCP1-外顯子 2/3/4 片段單倍型中，該單倍型還帶有接近 HCP1 的額外 SINE；因此，這種單倍型一定起源于金豺和其他狼類犬科動物的最后一個共同祖先 > 200 萬年前 (Ma)?10。盡管 16-kb HCP1-外顯子 2/3/4 片段單倍型可能起源于通向核心類狼犬科動物的分支，但它必須通過不完整的譜系分類和缺乏重組持續(xù)超過 200 萬年，并且通過三個物種形成事件（補(bǔ)充信息）。更可能的情況是 HCP1 代表了來自已滅絕犬科動物的幽靈血統(tǒng)（圖4d和5b) 是在更新世（下）期間通過與灰狼雜交而引入的，正如灰狼和土狼的祖先9以及高海拔西藏狼和喜馬拉雅狼11所暗示的那樣。

a，ASIP單倍型是從分布在整個北極地區(qū)的五只古狗（圓形）、兩只遠(yuǎn)古狼（正方形）和 68 只現(xiàn)代狼（餅圖）的 WGS 中推斷出來的（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7和補(bǔ)充表12顯示了詳細(xì)的單倍型表示）。星號表示 HCP1 插入缺失 (SY*) 或無法確定 (DY*) 的 SY/DY 單倍型。b, 主要黃色單倍型的起源及其傳遞給狗和北極狼的模型，其中模塊化啟動子的分子改變是通過基因滲入（紅色，HCP1）或灰狼的突變（藍(lán)色，VP1）獲得的。影響灰狼傳播的物種形成事件、狗馴化和地質(zhì)事件的時間表基于先前的研究10、33。

我們將對 VP 和 HCP 單倍型的分析擴(kuò)展到總共 45 只北美狼和 23 只歐亞狼。VP1-HCP1 單倍型組合主要在北美北極地區(qū)發(fā)現(xiàn)，其分布與白毛顏色平行（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a）12，在歐亞大陸未觀察到。我們還鑒定了一種祖先 HCP1 單倍型變體，以下稱為 HCP1?A，它不延伸到外顯子 2/3/4 并且缺乏在北極灰狼和顯性黃狗中發(fā)現(xiàn)的 24-bp 插入（圖4d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)）圖7?)。類似于陰影黃色的單倍型組合，VP2-HCP1?A，在來自西藏或內(nèi)蒙古的七只淺色狼中觀察到，它們代表了明顯比其他歐亞種群輕的高海拔灰狼種群（圖4d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6b）13。

對這些單倍型人口統(tǒng)計歷史的進(jìn)一步了解來自對?4-35 千年前 (ka)的古狗 (?n??= 5) 和灰狼 (?n = 2) 全基因組測序 (WGS) 數(shù)據(jù)的分析（補(bǔ)充信息）和補(bǔ)充表12），其中以各種組合觀察到兩種形式的 VP（VP1 和 VP2）和四種形式的 HCP（HCP1?A、HCP1、HCP2 和 HCP4）（圖5a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7） .?來自北極西伯利亞泰米爾湖和雅納河地區(qū)的古狼至少有一種 HCP1 單倍型，而來自中歐、愛爾蘭和西伯利亞的古狗則攜帶 HCP1?A，HCP1 和 HCP4 分別（補(bǔ)充表12）。因此，今天負(fù)責(zé)顏色變化的ASIP調(diào)節(jié)序列的多樣性在古代狼中為 35 ka，在古代狗中為 9.5 ka，這一點(diǎn)很明顯。

連同我們的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，狼和狗ASIP單倍型的比較分析表明，在進(jìn)化歷史中，多種衍生單倍型和相關(guān)的顏色模式是由對應(yīng)于白狼 (VP1-HCP1) 和灰狼的兩種祖先配置的重組和突變產(chǎn)生的（VP2-HCP2），兩者都存在于晚更新世（圖5a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7）。衍生單倍型的分布不僅解釋了狗的顏色模式多樣性，而且解釋了整個北極圈現(xiàn)代狼種群的顏色模式多樣性，包括北美北極的白狼 (VP1-HCP1) 和西藏高地的黃狼 (VP2-HCP1?A) 并且與淺色被毛顏色的自然選擇一致。圖5b描繪了驅(qū)動高水平ASIP表達(dá)的模塊起源的可能時間線，并指示了雙重起源。HCP1 單倍型代表從一個已滅絕的犬科動物譜系向更新世灰狼的基因滲入，該譜系從灰狼>2 Ma 分化而來。根據(jù)對古代狼樣本的直接觀察，這種基因滲入以及從 VP2 到 VP1 的突變發(fā)生在 33.5 ka 之前（圖5a）

討論

一個多世紀(jì)前，Sewall Wright?14認(rèn)識到ASIP與狗顏色模式之間的關(guān)系，并在隨后的幾十年中由 CC Little 的工作進(jìn)行了深入探索15。先前的研究報告了與某些狗的顏色模式相關(guān)的ASIP區(qū)域內(nèi)或周圍的分子變異，包括與黑色鞍座16相關(guān)的 16 bp 非編碼重復(fù)、與黑背和黑色鞍座16相關(guān)的 SINE 插入以及錯義變體 A82S 和R83H 與顯性黃色17相關(guān)（圖2a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2）。如此處所示，更廣泛數(shù)據(jù)集的可用性表明這些先前報道的關(guān)聯(lián)代表連鎖不平衡和/或品種結(jié)構(gòu)，而不是因果變異（補(bǔ)充表7）。相反，我們基于 WGS 對該區(qū)域的綜合注釋以及 RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)揭示了一系列結(jié)構(gòu)變體，這些變體為兩個啟動子中的每一個定義了不同的單倍型，它們結(jié)合起來解釋了五種不同的模式類型（圖2c）。

在狗中，VP1 和 VP2 之間的主要區(qū)別是一個 SINE 元素和一個小插入；同樣，HCP1 和 HCP2 之間的主要區(qū)別在于多個 SINE 元素和一個小的插入（圖2b）。在每種情況下，我們還不知道轉(zhuǎn)錄差異（VP1 > VP2 和 HCP1 > HCP2）是由 SINE 元素、小插入還是兩者兼而有之。然而，我們注意到，ASIP調(diào)節(jié)變異的模塊化是脊椎動物的一個普遍主題，非編碼變化推動了鹿鼠3、山野兔18、雪鞋野兔8和幾種鸚鵡鶯19、20的自然種群的適應(yīng)，21?,?22.?同樣，山羊23、家兔24、25和實(shí)驗(yàn)室小鼠26的人工選擇與ASIP調(diào)節(jié)區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)，這可能導(dǎo)致獲得調(diào)節(jié) ASIP 區(qū)域特異性表達(dá)的啟動子。

ASIP顏色圖案多樣化可能是狗馴化過程中的一個早期事件，因?yàn)槲覀儗糯?DNA 數(shù)據(jù)的分析揭示了歐亞大陸 4.8 ka 的幾種不同的 VP 和 HCP 單倍型。這與來自不同地點(diǎn)的現(xiàn)代犬種的主要黃色廣泛分布一致，以及野狗（補(bǔ)充表9），一種野生馴化，經(jīng)常占主導(dǎo)地位的黃色，至少 3.5 ka 引入澳大利亞（參考文獻(xiàn)27）。特別感興趣的是來自西伯利亞的佐科夫島犬28?,?29.?在VP2-HCP4的單倍型組合的基礎(chǔ)上，這只活9.5ka的雪橇犬呈現(xiàn)出黑色的背色圖案，使其在北極環(huán)境中很容易與白色的狼區(qū)分開來。

在狼群中，VP1 和 HCP1 的自然選擇可能是更新世適應(yīng)北極環(huán)境和冰川避難所的遺傳交換的結(jié)果，這是由間冰期犬科動物和巨型動物的擴(kuò)散驅(qū)動的?，F(xiàn)代灰狼被認(rèn)為起源于單一來源~25 ka，接近最后一次冰川最大值30?,?31；在隨后的北美冰川退縮期間，VP1-HCP1 單倍型組合被選擇用于今天的白色北極狼。我們的研究結(jié)果顯示了基因滲入、人口歷史和已滅絕犬科動物的遺傳遺產(chǎn)如何在塑造狗和現(xiàn)代灰狼的多樣性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

注腳：

道德聲明

所有動物實(shí)驗(yàn)均按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)得到了“州動物實(shí)驗(yàn)委員會”（伯爾尼州；許可證 48/13、75/16 和 71/19）的批準(zhǔn)。

皮膚活檢和總 RNA 提取

由于與本研究無關(guān)的原因，在尸檢和/或手術(shù)中從三只狗（黑背微型短毛獵犬和占主導(dǎo)地位的黃色邊境梗和愛爾蘭梗）中回收了皮膚活檢（6 毫米穿孔）。活檢取自腹腹和背胸，與年齡或毛發(fā)生長周期不匹配?；顧z立即放入 RNAlater (QiAGen) 中至少 24 小時，然后在 –20 °C 下冷凍。在提取 RNA 之前，使用來自 QiAGen 的 TissueLyser II 設(shè)備對皮膚活檢進(jìn)行機(jī)械均質(zhì)化。根據(jù)制造商的說明，使用 RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (QiAGen) 從勻漿組織中提取總 RNA。使用片段分析儀（AGilent）評估 RNA 質(zhì)量，并使用 Qubit 熒光計（ThermoFisher Scientific）測量濃度。

全轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）

使用 Illumina TruSeq Stranded mRNA 試劑盒從每個樣品中提取 1 μg 高質(zhì)量總 RNA（RNA 完整性數(shù) > 9）用于文庫制備。使用 Illumina NovaSeq 6000 儀器對文庫進(jìn)行單獨(dú)條形碼化和匯集，并在 S1 流動槽上進(jìn)行 2 × 50 bp 雙端測序。平均而言，每個樣本收集了 3150 萬條配對末端讀數(shù)。使用了一個公開可用的 BeAGle 樣本 (SRX1884098)。所有登錄號和描述性讀取統(tǒng)計數(shù)據(jù)在補(bǔ)充表8中給出。所有通過質(zhì)量控制的讀數(shù)都使用 STAR aligner (v.2.6.0c)?34映射到 CanFam3.1 參考基因組組裝。

成績單坐標(biāo)

STAR-aligned bam 文件在集成基因組查看器 (IGV) 瀏覽器35中可視化。根據(jù)剛剛描述的 RNA-seq 數(shù)據(jù)，基于 IGV 中讀取比對的可視化，定義了三個不同的交替未翻譯的第一外顯子，它們與ASIP的編碼外顯子具有剪接點(diǎn)。這些確切的成績單沒有記錄在國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）中；然而，NCBI 注釋版本 105 的三個轉(zhuǎn)錄本實(shí)際上是相同的，除了關(guān)于 5' 非翻譯區(qū)長度的微小差異（XM_014106843.2，與我們的注釋相比，轉(zhuǎn)錄起始父系 (TSS) 上游 22 個核苷酸；NM_001007263.1，VP1-TSS 98 bp 下游我們的注釋；XM_022408819.1?HCP-TSS 36 bp 我們注釋的下游）。我們的視覺策劃基因模型在補(bǔ)充表2中給出。

基因組變異的鑒定

來自 71 只狗和 6 只狼的 WGS 數(shù)據(jù)用于變異發(fā)現(xiàn)（補(bǔ)充表3）。其中包括15只刺豚鼠和狼、25只黑背狗、11只黑鞍狗、14只顯性黃狗、11只陰影黃狗和1只白狼。這些基因組要么是公開的，要么是作為我們小組相關(guān)項(xiàng)目的一部分進(jìn)行測序的36。SNVs 和小插入缺失被稱為描述36。IGV 軟件35基于 RNA-seq 數(shù)據(jù)中鑒定的轉(zhuǎn)錄本，用于目視檢查三個啟動子區(qū)域。通過在 IGV 中的目視檢查，鑒定了結(jié)構(gòu)變體并驗(yàn)證了與毛色表型的關(guān)聯(lián)。第三個啟動子的拷貝數(shù)變異模式與圖1中定義的外殼模式無關(guān)。

用于 Sanger 測序和基因分型的 DNA 樣本

用于變異發(fā)現(xiàn)的樣本包括來自每種顏色表型的兩只狗，并在補(bǔ)充表3中用星號表示。來自補(bǔ)充表4中列出的狗的樣本用于基因分型。所有動物的毛色表型（補(bǔ)充表3和4）是根據(jù)特定品種的毛色標(biāo)準(zhǔn)或照片或所有者報告分配的。使用 Maxwell RSC 全血 DNA 試劑盒 (Promega) 從 EDTA 血液樣本中分離基因組 DNA。

啟動子區(qū)域的測序

對 PCR 擴(kuò)增子進(jìn)行 Sanger 測序，以在序列水平上驗(yàn)證和表征啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)變體。使用的所有引物序列和聚合酶列于補(bǔ)充表5中。使用 LA Taq 聚合酶 (Takara) 或 Multiplex PCR Kit (QiAGen) 擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物在用核酸外切酶 I 和蝦堿性磷酸酶處理后直接在 ABI 3730 毛細(xì)管測序儀上測序。用 Sequencher 5.1 (GeneCodes) 分析序列數(shù)據(jù)。使用RepeatMasker 程序37對散在的重復(fù)插入進(jìn)行分類.?以這種方式解決了來自相同和不同系列的 SINE 元素的多個副本。CanFam3.1 參考基因組組裝來自 Boxer Tasha，一種顯性的黃狗，代表ASIP基因的 DY 單倍型 VP1-HCP1。HCP2-5 的啟動子變體和 Genbank 登錄號的描述在補(bǔ)充表1中。補(bǔ)充表1列出了在狗中觀察到的 VP 和 HCP 調(diào)節(jié)模塊的七種組合。由于 HCP3、4 和 5 都代表功能等效的功能喪失等位基因，因此列出的七種組合僅對應(yīng)于五種不同的表型。

基因分型分析

需要五次 PCR 測定（腹側(cè)啟動子測定 1 和 2 以及毛發(fā)周期啟動子測定 1、2 和 3）來明確確定 VP 和 HCP 單倍型（補(bǔ)充表5）。先前報道的 SINE 插入32在 ABI 3730 毛細(xì)管測序儀上通過片段大小分析進(jìn)行基因分型，并使用 GeneMapper 4.0 軟件（applied Biosystems）進(jìn)行分析。先前報道的ASIP編碼變體17通過 PCR 產(chǎn)物的 Sanger 測序進(jìn)行基因分型。先前報道的RALY內(nèi)含子重復(fù)16在片段分析儀（安捷倫）上通過 PCR 產(chǎn)物的大小差異進(jìn)行基因分型。另一對引物用于擴(kuò)增整個 HCP（補(bǔ)充表5）。所有樣品的基因分型結(jié)果顯示在補(bǔ)充表4中。352 只狗存在完美的基因型-表型關(guān)聯(lián)（表1和補(bǔ)充表7）。在剩下的 14 只狗中，存在 eumelanistic 面具阻止了顯性黃色和陰影黃色狗的可靠表型分化。品種和在每個品種中鑒定的不同啟動子單倍型組合在補(bǔ)充表6中顯示.?在一些 VP 和 HCP 都是雜合子的狗中，VP 和 HCP 單倍型組合的定相是根據(jù)所述同一品種內(nèi)的單倍型頻率進(jìn)行的。一個支奴干家族用于確定擴(kuò)展單倍型的分離以及 HCP3 和 5 的表型等效性（圖3）?；蚍中徒Y(jié)果的總結(jié)和先前相關(guān)變體的排除見表1和補(bǔ)充表7。補(bǔ)充表7列出了聚合形式的基因型-表型關(guān)聯(lián)；它還包含先前報道與模式表型 16、17、32 相關(guān)的變體的基因型。

啟動子單倍型對轉(zhuǎn)錄本影響的比較

轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)是從第二組樣本中生成的。樣品描述和顏色顯示在補(bǔ)充表8中適用于所有 RNA 實(shí)驗(yàn)。由于與皮膚無關(guān)的行為或健康問題而進(jìn)行的安樂死后，從雄性瑞典麋鹿 (AGouti)、雌性德國短毛獵犬 (主要黃色) 和雄性羅威納犬 (黑背) 中收集皮膚樣本。樣品收集在 RNAlater Stabilization Solution 中并儲存在 –80 °C。根據(jù)制造商的說明，使用 RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (QiAGen) 提取 RNA。使用 AGilent 2100 生物分析儀或 TapeStation 系統(tǒng) (AGilent) 評估 RNA 的完整性，并使用 DeNovix DS-11 分光光度計 (DeNovix Inc.) 測量濃度。STRT（單細(xì)胞反向標(biāo)記）RNA-seq 文庫是使用具有唯一分子標(biāo)識符的 STRT 方法制備的38和修改，包括更長的 8 bp 唯一分子標(biāo)識符、添加 ERCC 對照 RNA 中的尖峰以使表達(dá)正?；约笆褂?LNA 引物用于犬 α 和 β 珠蛋白基因的 Globin lock 方法39 。使用 Illumina NextSeq 500 對文庫進(jìn)行測序。使用 HISAT1 mapper v.2.1.0（參考文獻(xiàn)40）將讀數(shù)映射到 CanFam3.1 基因組構(gòu)建。

無比對量化方法 Kallisto (v.0.46.0)?41用于估計豐度，并根據(jù) CanFam3.1 Ensembl 轉(zhuǎn)錄組（版本 99）構(gòu)建的索引，將其量化為每百萬映射讀取 (TPM) 數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄本.?基于 IGV 瀏覽器35中的比對可視化的策劃ASIP轉(zhuǎn)錄亞型模型也包含在轉(zhuǎn)錄組中?；趩幼訂伪缎突蛐偷慕Y(jié)果在擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1中顯示為 TPM。

單倍型構(gòu)建

單倍型由兩個公開可用的 VCF 文件PRJEB32865和PRJNA448733 構(gòu)建。所選狗的 VCF 使用 BCFtools 合并工具 (?http://samtools.github.io/bcftools/?) 與參數(shù) --missing-to-ref 合并，假設(shè)缺失位點(diǎn)的基因型是純合參考類型 0/0。只有ASIP單倍型（VP、HCP 和編碼外顯子）純合的狗用于可視化單倍型（補(bǔ)充表3）。在這些樣本中具有 100% 檢出率的 SNV 進(jìn)行了顏色編碼，并相對于基因組組裝和先前相關(guān)的變體顯示（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2）。

犬科動物的ASIP系統(tǒng)發(fā)育分析

36 種犬科動物（包括 7 種現(xiàn)存物種和狗）的 Illumina 全基因組序列從 NCBI 短讀長檔案中下載為對齊（bam 格式）或未對齊（fastq 格式讀取（補(bǔ)充表9））。在使用 Trim Galore (v.0.6.4) 修剪后，使用 BWA (v.0.7.17)?42將 Fastq 數(shù)據(jù)與狗基因組 (CanFam3.1) 對齊。包括ASIP轉(zhuǎn)錄單位和調(diào)控序列在內(nèi)的 110 kb 區(qū)間 (chr24: 23,300,000–23,410,000) 內(nèi)的 SNV用鴨嘴獸 (v.0.8.1)?43進(jìn)行鑒定，并用 VCFtools (v.0.1.15)?44過濾到包括 2,008 個雙等位基因 SNV。使用 BEAGLE (v.4.1)?45推斷相位。

對于系統(tǒng)發(fā)育分析，基于狗 SNV 密度（圖4a）和ASIP基因結(jié)構(gòu)，?ASIP區(qū)間被劃分為兩個區(qū)域：一個 48-kb 區(qū)域，包括腹側(cè)第一外顯子，延伸到但不包括毛發(fā)周期第一外顯子(chr24:23,330,000–23,378,000) 和一個 16 kb 區(qū)域，包括毛發(fā)周期第一個外顯子，延伸到并包括ASIP編碼外顯子 2–4 (chr24: 23,378,001–23,394,000)。使用 BCFtools (v.1.9) 為每個推斷的犬單倍型構(gòu)建了相等長度的共有序列。系統(tǒng)發(fā)育是使用最大似然法和 Tamura-Nei 模型推斷的，具有 250 次自舉復(fù)制，在 MEGAX中實(shí)施46、47并包括 34 只犬科動物（圖4b和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3和圖4）。對于 36 個個體中的 34 個，共有單倍型對彼此相鄰，或者在少數(shù)狼/狗單倍型的情況下，位于具有弱引導(dǎo)支持的相鄰分支中。非洲金狼是個例外，它是灰狼和埃塞俄比亞狼9和來自五大湖地區(qū)的東部灰狼最近雜交衍生的物種，據(jù)報道它最近也與土狼混合48。將非洲金狼和東部灰狼從比對中移除，并任意選擇每個個體的單個單倍型用于樹木構(gòu)建和展示。

古犬狼ASIP位點(diǎn)單倍型分析

來自最近幾項(xiàng)研究的 WGS 數(shù)據(jù)9、13、29、49、50、51、52、53，包括五只古代狗、兩只古代灰狼和 68 只現(xiàn)代灰狼（補(bǔ)充表12）被下載為對齊（bam 格式）或未對齊（fastq 格式）讀取。在使用 Trim Galore (v.0.6.4) 修剪后，使用 BWA-MEM (v.0.7.17)?42將 Fastq 數(shù)據(jù)與狗基因組 (CanFam3.1) 對齊。每個樣本的覆蓋深度范圍為 1 到 78 倍（補(bǔ)充表12）。使用 IGV 瀏覽器通過目測確定五個結(jié)構(gòu)變體和六個 SNV 的基因型（補(bǔ)充表1和12）。腹側(cè)啟動子 ( n??= 2)、毛發(fā)周期啟動子 (?n??= 6) 和編碼外顯子 (?n?= 3)中或附近的變體?區(qū)分腹側(cè)和毛發(fā)周期啟動子單倍型（補(bǔ)充表12）。SNV 基因型由等位基因計數(shù)確定；通過斷點(diǎn)連接處的拆分讀取對結(jié)構(gòu)變體進(jìn)行基因分型。用于繪制單倍型地理分布的基礎(chǔ)圖（圖5和補(bǔ)充圖6）是在 R（v.4.0.3）中使用“maps”和“ggplot2”包生成的。

對于 75 只狼（或古老的狗）中的 67 只，腹側(cè)和毛發(fā)周期啟動子單倍型的階段是明確的。七只狼和一只古老的狗在腹側(cè)和毛發(fā)周期啟動子單倍型方面是雜合的，對于這些樣品，單倍型階段是根據(jù) 67 個明確個體中的連鎖不平衡推斷的。