蛋白質(zhì)印跡 (Western blot, WB) 是一種通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將其印跡轉(zhuǎn)移到膜上，并對(duì)固定抗原進(jìn)行選擇性免疫檢測的技術(shù)。這是一種重要的常規(guī)蛋白質(zhì)分析方法，依賴于抗體-抗原相互作用的特異性，對(duì)于從復(fù)雜混合物中定性或半定量鑒定特定蛋白質(zhì)及其分子量非常有用。

原理：

WB從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物開始，通過凝膠電泳利用電荷和分子質(zhì)量將其分離，并將分離的蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到膜上。然后將膜培養(yǎng)在含有已知能與目的蛋白結(jié)合的抗體（一抗）溶液中孵育，該過程中一抗與目的蛋白結(jié)合。此后將膜培養(yǎng)在含有已知能與一抗結(jié)合的抗體（二抗）溶液中孵育，該過程中二抗與一抗結(jié)合，抗體形成蛋白 (protein of interest) -抗體 (primary antibody) -抗體 (secondary antibody) -HRP (peroxidase) 支架。ECL底物 (ECL substrate)?中含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）作用下可發(fā)出熒光，即可用化學(xué)發(fā)光檢測支架。支架以特定分子量的“帶”形式存在，將膜上的條帶與分子量標(biāo)記進(jìn)行比較，可確定樣品中是否存在目的蛋白并提供有關(guān)其分子量的信息。

實(shí)驗(yàn)流程:

1. 電泳 (SDS-PAGE)?

1.1.?制膠

1.1.1. 分離膠：將玻璃板疊放整齊（避免漏膠）并夾好固定于底座上，同時(shí)確定灌膠位置。配置分離膠并混勻，將制好的分離膠滴入玻璃板間（需使膠沿玻璃板流下避免氣泡產(chǎn)生）直至確定好的位置處。加水液封（速度需慢避免將膠沖變形）后靜置，待膠充分凝固后倒去上層水或用濾紙吸去水層。

1.1.2. 濃縮膠：配置濃縮膠并混勻，將制好的濃縮膠滴入玻璃板間（操作同分離膠）。輕輕插入梳子后靜置，待膠充分凝固即制成膠板。

1.2. 上樣電泳

1.2.1. 對(duì)照：(i) marker：預(yù)染或非預(yù)染的已知分子量蛋白質(zhì)混合物，可指示蛋白質(zhì)條帶大小和示蹤；(ii) 陽性對(duì)照：目的蛋白或已知表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞系或組織裂解物，可檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)有效性；(iii)?陰性對(duì)照：已知不表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞系或組織裂解物，可檢查是否存在非特異性結(jié)合及假陽性；(iv)?上樣對(duì)照：管家蛋白抗體或在幾乎所有組織細(xì)胞中表達(dá)水平相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)，可確保凝膠中所有泳道含有等量樣品并估量樣品中蛋白質(zhì)量；(v) 無一抗對(duì)照：只加二抗未加一抗，可指示是否存在由于二抗的非特異性結(jié)合而造成的任何非特異性結(jié)合或假陽性；(vi)?內(nèi)源性對(duì)照裂解物：重組蛋白質(zhì)樣品。

1.2.2. 上樣：將膠板放入電泳槽中固定（通常兩塊凝膠板共用一個(gè)電源架，凹沿面需靠向電源架；若只跑一塊膠，另一邊需墊塑料板），按要求加入電泳緩沖液（電泳液至少漫過內(nèi)側(cè)小玻璃板）。拔出梳子（兩手分別捏住梳子兩邊豎直向上輕輕將其拔出），用微量進(jìn)樣器吸取適量樣品液（需避免吸入氣泡）并將樣品液緩慢加入凝膠板內(nèi)加樣孔（加樣過快可能使樣品沖出加樣孔）。

1.2.3. 電泳：連接導(dǎo)線（注意正負(fù)極），上層膠用低壓恒壓電泳，溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠后用高壓恒壓電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)膠板底端附近停止電泳。

2. 轉(zhuǎn)膜

2.1. 膜的選擇：根據(jù)蛋白特性及分子大小等因素選擇合適雜交膜，WB常用的膜主要有NC膜和PVDF膜。(i) NC膜：與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)活性影響??；非特異性本底顯色淺；價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失；膜韌性較差易損壞。(ii) PVDF膜：與蛋白質(zhì)親和力高，但用前需在甲醇中浸泡以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合，適合低分子量蛋白的檢測。

2.2. 轉(zhuǎn)膜（濕式）：配置轉(zhuǎn)膜液，將轉(zhuǎn)膜所需器具浸入加有轉(zhuǎn)移液的托盤中，并在轉(zhuǎn)膜液中預(yù)先趕走海綿墊中氣泡。將凝膠板玻璃輕輕撬開，除去濃縮膠并將分離膠從玻璃板上剝離（可在加有轉(zhuǎn)移液的托盤中操作）并標(biāo)記樣品順序（切去膠的一個(gè)小角）。裁剪合適大小的膜（與分離膠大小相同）并在與膠相同位置剪去一小角指示電泳方向及吸附有蛋白的膜面，PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和而NC膜不需要。在轉(zhuǎn)膜裝置上從負(fù)極（黑底）到正極依次放置海綿墊、濾紙、分離膠、膜、濾紙和海綿墊片（由下而上；若海綿墊足夠厚可不需濾紙），放置時(shí)每層都需除氣泡。（涉及到膠的操作必須輕柔以避免將膠弄破）將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中（注意正負(fù)極），由于轉(zhuǎn)膜時(shí)放熱，可在槽的一邊放冰并將轉(zhuǎn)膜槽埋于冰中，設(shè)置好電壓和時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

3. 封閉

3.1. 封閉劑的選擇：為防止雜交膜上非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)與抗體結(jié)合引起非特異性染色和背景，需用惰性蛋白或非離子去污劑封閉膜上未結(jié)合位點(diǎn)，封閉劑應(yīng)封閉所有未結(jié)合位點(diǎn)而不替換膜上的目的蛋白、不結(jié)合目的蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。常見封閉劑有BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或者 TBST。

3.2. 封閉：將膜置于適宜封閉劑中于室溫下緩慢震蕩1-2h，封閉完成后進(jìn)行洗膜（TBST溶液）。

4. 抗體孵育

用封閉液稀釋一抗至適宜濃度（說明書建議或一般推薦倍數(shù)1:1000-1:2000），從封閉液中取出膜置于保鮮膜內(nèi)并將稀釋好的一抗溶液滴入保鮮膜中，滴好后趕出保鮮膜中殘留氣泡并封好保鮮膜。將膜于4℃下在搖床上孵育過夜，孵育完成后吸取一抗并洗膜。同上述方法進(jìn)行二抗孵育（1-2h），孵育完成后洗膜。

5. 化學(xué)發(fā)光

配置發(fā)光液（注意避光），吸取適量發(fā)光液覆蓋至膜上并于ECL發(fā)光儀上曝光采集圖像進(jìn)行分析。

參考：

[1]?Hirano, S. (2012). Western Blot Analysis. In: Reineke, J. (eds) Nanotoxicity. Methods in Molecular Biology, vol 926. Humana Press, Totowa, NJ. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-002-1_6

[2]?Hnasko, T.S., Hnasko, R.M. (2015). The Western Blot. In: Hnasko, R. (eds) ELISA. Methods in Molecular Biology, vol 1318. Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2742-5_9

[3]?Kim, B. (2017). Western Blot Techniques. In: Espina, V. (eds) Molecular Profiling. Methods in Molecular Biology, vol 1606. Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6990-6_9

[4]?無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司

[5]?劉忠民，常曉彤. 臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 武漢：華中科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社, 2020.

[6]?葉棋濃.生物實(shí)驗(yàn)室系列 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與實(shí)驗(yàn)技巧[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社.2015.

[7]?馬文麗. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社, 2011.