只要你對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)稍微有些了解，就一定知道在CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)中，gRNA的設(shè)計(jì)將很大程度上影響項(xiàng)目的成功率。Cas9核酸酶在gRNA的指引下，打靶目的基因，并產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（DSB）。由于DSB的不完全修復(fù)而產(chǎn)生插入和缺失（indels），引起移碼突變，導(dǎo)致終止密碼子提前，實(shí)現(xiàn)編碼基因敲除的目的。但往往很多人在設(shè)計(jì)gRNA這一步就屢屢碰壁，我們本周也收到了一些關(guān)于gRNA的設(shè)計(jì)與選擇的問(wèn)題，今天就和大家一起討論：

Q1：通常在構(gòu)建CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除某種基因的時(shí)候選用的是單gRNA還是雙gRNA，它們兩者有什么區(qū)別嗎？

A：理論上講單gRNA只能靶向基因的1個(gè)位點(diǎn)，敲除的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量有限，脫靶率較高，而雙gRNA能在很大程度上解決這兩個(gè)問(wèn)題，也能實(shí)現(xiàn)較大的基因片段敲除，因此雙gRNA載體的敲除效果會(huì)比單gRNA載體好，但實(shí)際操作中，要具體情況具體分析，提前制定合適的實(shí)驗(yàn)方案，才能在最少的預(yù)算中得到想要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們目前會(huì)使用紅棉CRISPR基因編輯系統(tǒng)（點(diǎn)擊使用）進(jìn)行基因敲除方案的智能設(shè)計(jì)，因?yàn)樗狭?000多例基因編輯成功案例的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及幾個(gè)主流的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，只需要輸入基因名稱就可以免費(fèi)得到3套優(yōu)質(zhì)方案，能減少我們的實(shí)驗(yàn)試錯(cuò)成本。

Q2：請(qǐng)問(wèn)gRNA有哪些設(shè)計(jì)規(guī)則，可以推薦一個(gè)好用的gRNA設(shè)計(jì)工具嗎？

A：首先設(shè)計(jì)gRNA時(shí)需要考慮很多因素，這里就提三個(gè)必須要遵守的規(guī)則：
gRNA的序列特異性要足夠強(qiáng)；
gRNA序列要盡量覆蓋較多的轉(zhuǎn)錄本；
避免編碼氨基酸的靶向區(qū)域過(guò)于接近蛋白質(zhì)的N端或C端；
但事實(shí)上我們通常是借助gRNA設(shè)計(jì)工具來(lái)進(jìn)行g(shù)RNA的設(shè)計(jì)，一個(gè)好用的gRNA設(shè)計(jì)工具可以讓我們事半功倍，減少試錯(cuò)成本，推薦你可以將張峰實(shí)驗(yàn)室的sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站和我們紅棉系統(tǒng)的gRNA設(shè)計(jì)工具搭配使用，不過(guò)有一點(diǎn)還需要提醒的是，并不是gRNA的分?jǐn)?shù)越高，它的敲除效果就越好，你可以通過(guò)紅棉系統(tǒng)全面了解所編輯的基因再做出符合實(shí)際的選擇。

Q3： 如何提高gRNA的打靶效率？

A：如何提高gRNA的打靶效率是每個(gè)研究CRISPR/Cas9技術(shù)的科研人員都十分關(guān)注的問(wèn)題，不論是從gRNA的序列優(yōu)化，還是改變gRNA載體的傳遞方式，又或者是增加gRNA的數(shù)量等等，都可以在一定程度上提高gRNA的打靶效率，總之提高打靶效率的方法有很多種，要結(jié)合具體情況進(jìn)行優(yōu)化，如果需要幫助，歡迎使用我們免費(fèi)的紅棉CRISPR基因編輯系統(tǒng)或者咨詢我們！