那么這本雜志上的文章還值得借鑒嗎？小云今天特意挑選了一篇雙疾病的生信文章，跟大家一起來點(diǎn)評一下吧（ps：估計(jì)后面也不會(huì)分享這個(gè)雜志的文章了，除非還有什么轉(zhuǎn)機(jī)~）。

（不知道如何找熱點(diǎn)或創(chuàng)新升級的可以找小云，各種個(gè)性化分析思路等你來挑~）

小云看完這篇文章之后，覺得值得一說的點(diǎn)有3個(gè)：

（1）?驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；

（2）?反向驗(yàn)證集的應(yīng)用；

（3）構(gòu)建了疾病診斷的在線預(yù)測工具；

一起來看看吧~

題目：C1QC、VSIG4和CFD作為心房顫動(dòng)相關(guān)心源性栓塞性卒中的潛在外周血生物標(biāo)志物

雜志：Oxidative medicine and cellular longevity

影響因子：7.31無

發(fā)表時(shí)間：2023年1月

數(shù)據(jù)信息

研究思路

從GEO數(shù)據(jù)庫下載心房顫動(dòng)(AF)、心源性栓塞性卒中(CE)和大動(dòng)脈粥樣硬化(LAA)相關(guān)的基因表達(dá)譜，鑒定差異表達(dá)基因(DEGs)，然后進(jìn)行功能注釋。通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法SVM-RFE和LASSO回歸分析，鑒別潛在的診斷房顫相關(guān)心源性栓塞性腦卒中(AF-CE)生物標(biāo)志物。通過使用外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證結(jié)果，并通過ROC曲線下面積(AUC)來衡量診斷價(jià)值。RT-qPCR驗(yàn)證生物標(biāo)志物的表達(dá)。最后，開發(fā)了一個(gè)nomogram和配套網(wǎng)站來預(yù)測CE風(fēng)險(xiǎn)率。

主要研究結(jié)果

1.?分析差異表達(dá)基因（DEGs）并進(jìn)行功能分析

在與CE相關(guān)的數(shù)據(jù)集中，與對照組相比，中風(fēng)后3小時(shí)、5小時(shí)和24小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別篩選了DEGs，取交集獲得了418個(gè)DEGs(圖1(e))。同時(shí)，從AF相關(guān)的數(shù)據(jù)集中篩選DEGs，與這些CE相關(guān)的DEGs取交集，得到316個(gè)AF-CE相關(guān)基因(圖1(f))。另外，將這兩個(gè)疾病的GEO數(shù)據(jù)集合并為訓(xùn)練集，從合并的訓(xùn)練集中獲得了13個(gè)AF-CE相關(guān)的DEGs基因(圖1(g))。

使用Metscape在線工具對316個(gè)AF-CE相關(guān)的DEGs進(jìn)行功能注釋(圖1(a))和DO富集分析(圖1(b))。

圖1. DEGs和功能分析

2.?利用LASSO和SVM-RFE算法選擇診斷標(biāo)記并驗(yàn)證

使用兩種不同的算法(LASSO和SVM-RFE)從組合訓(xùn)練集中篩選特征基因。最終篩選出LASSO和SVM-RFE算法與GEO2R篩選的DEGs共同的7個(gè)特征基因作為AF-CE患者的診斷標(biāo)志物(圖2(a))。7個(gè)特征基因的ROC分析AUC值均大于0.8 (圖2(b))。

（ps：機(jī)器學(xué)習(xí)算法可以用小云新開發(fā)的零代碼生信分析小工具實(shí)現(xiàn)，云生信分析工具平臺包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)一鍵出圖，感興趣的小伙伴歡迎來嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html?）。

合并兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證集驗(yàn)證這7個(gè)候選診斷基因的可靠性和可重復(fù)性(圖2(c))。而在反向驗(yàn)證集--動(dòng)脈粥樣硬化數(shù)據(jù)集中，C1QC、VSIG4和CFD的表達(dá)無明顯差異(圖4(d))。說明特征生物標(biāo)志物VSIG4、C1QC和CFD具有較高的診斷準(zhǔn)確性。

（小云說：這里反向驗(yàn)證集證明了診斷基因的可靠，可以參考~）

圖2. 利用LASSO和SVM-RFE算法選擇診斷標(biāo)記并驗(yàn)證

3.?診斷生物標(biāo)記物的通路分析和免疫浸潤分析

利用PathCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析(圖3(a))，發(fā)現(xiàn)VSIG4、C1QC和CFD可能與AF-CE的調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)。

因此，進(jìn)一步分析患者樣本、中風(fēng)后3、5和24小時(shí)與對照樣本之間免疫細(xì)胞浸潤分布的差異，以及特征生物標(biāo)志物(VSIG4、C1QC和CFD)與浸潤免疫細(xì)胞的相關(guān)性(圖3(b))。

圖3. 通路分析和免疫浸潤分析

4.?臨床標(biāo)本中診斷基因的表達(dá)驗(yàn)證，以及ROC曲線評估診斷價(jià)值

收集了患者的53份臨床血樣(LAA型缺血性腦卒中患者20份，CE患者20份，對照組13份)，qRT-PCR檢測診斷基因的表達(dá)（圖4(a) -4?(b)）。

（小云說：這里驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量也不少，而且分組也注意區(qū)分了不同類型的疾病~）

構(gòu)建ROC曲線評價(jià)候選診斷基因的診斷準(zhǔn)確性(圖4(e)、(g)、(k))。結(jié)果表明，C1QC、VSIG4和CFD表達(dá)在區(qū)分對照組、CE和LAA患者方面具有很大的價(jià)值，并且對所分析的兩種腦卒中亞型具有特異性，可能是AF-CE的診斷生物標(biāo)志物。

圖4. qRT-PCR驗(yàn)證和ROC曲線

5.?AF-CE診斷Nomogram和在線預(yù)測工具的構(gòu)建和評估

基于3個(gè)診斷基因(C1QC、CFD和VSIG4)構(gòu)建了診斷AF-CE的nomogram(圖5(a))。決策曲線分析(DCA)和曲線下面積(AUC)表明nomogram模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測AF-CE?(圖5(b)-(c))。校準(zhǔn)曲線表明nomogram預(yù)測AF-CE的準(zhǔn)確性較高。

圖5. 預(yù)測AF-CE風(fēng)險(xiǎn)的Nomogram

為了臨床應(yīng)用，作者開發(fā)了一個(gè)在線預(yù)測工具(https://www.origingenetic.com/CardiogenicStroke?)，基于構(gòu)建的nomogram來預(yù)測AF-CE的風(fēng)險(xiǎn)。將候選診斷基因(C1QC、CFD和VSIG4)的表達(dá)水平輸入在線預(yù)測工具。臨床驗(yàn)證結(jié)果顯示，所有AF-CE患者測試樣本得分接近100%，而健康對照組得分接近0%，這表明預(yù)測軟件具有較高的準(zhǔn)確性。

（小云說：作者還特意開發(fā)了一個(gè)疾病在線預(yù)測工具，便于臨床應(yīng)用，說明篩選出的診斷基因是認(rèn)真的哦~）

圖6. 在線預(yù)測工具

6.?臨床病理參數(shù)與候選疾病生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性

分析了三個(gè)候選基因(C1QC、CFD和VSIG4)的表達(dá)與AF-CE患者的臨床病理特征之間的聯(lián)系（圖7）。

圖7. C1QC、CFD、VSIG4與臨床病理特征的相關(guān)性

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總結(jié)

怎么樣，看完被SCI剔除雜志上的這篇雙疾病的生信文章，你覺得值得借鑒嗎？

如果非要讓小云說值得借鑒的點(diǎn)的話，可能就是 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、反向驗(yàn)證集的應(yīng)用、和構(gòu)建了疾病診斷的在線預(yù)測工具了。

順便回顧一下小云之前給大家總結(jié)的雙疾病分析驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)怎么加：

（1）?可以采用驗(yàn)證數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出的多個(gè)hub基因中，只要有幾個(gè)有陽性結(jié)果就可以；

（2）?如果疾病沒有其他的驗(yàn)證數(shù)據(jù)集或者驗(yàn)證數(shù)據(jù)集沒有陽性結(jié)果，可以考慮采用臨床樣本驗(yàn)證；

（3）?不管用驗(yàn)證數(shù)據(jù)集還是臨床樣本、或者一種疾病用驗(yàn)證集+另一種疾病用臨床樣本驗(yàn)證，最好是兩種疾病都要驗(yàn)證成功；

（4）?如果能收集到兩種疾病共患病的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證是最佳的加分項(xiàng)！

另外，雙疾病分析也可以分析診斷基因，基于hub基因構(gòu)建診斷模型并評估其對疾病的診斷價(jià)值，增加臨床意義。

其實(shí)不止雙疾病分析，所有的生信分析做完后都會(huì)面臨著要補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的問題，具體該補(bǔ)什么實(shí)驗(yàn)，補(bǔ)多少呢？小云還專門給大家總結(jié)了一下，詳見：濕實(shí)驗(yàn)大盤點(diǎn)，助力您的生信分析文章檔次提升，快快收藏！?

如果你還苦惱于生信分析沒有思路，或者嫌分析方法太過簡單、太過老套，想要?jiǎng)?chuàng)新思路的，或者對雙疾病等方向感興趣的小伙伴快來聯(lián)系小云吧！